黄 瑛，王 洋，王志刚，杨利峰，赵德明*

(1.中国农业大学动物医学院/国家动物海绵状脑病实验室，北京 100193；2.中国动物疫病预防控制中心，北京 100125)

牛分枝杆菌( Mycobacterium bovis)PE和PE-PGRS蛋白家族由一簇多拷贝的多态性重复序列组成，该蛋白家族的N-末端富含Pro-Glu基因序列，而C-末端富含Gly-重复序列[1]。研究表明，PE-PGRS蛋白家族在M.bovis细胞膜表面表达，能够直接与宿主细胞相互作用。不同的外界环境(如低pH、缺氧和营养缺乏)，其表达情况也存在显著差异[2-4]。有研究显示，PE和PE-PGRS蛋白家族在结核分枝杆菌持续感染的过程中具有重要作用。Ramakrishnan等证实，感染结核杆菌后，在特异性肉芽肿形成过程中，结核杆菌MAG 24基因(PE_PGRS62同源性基因)显著上调，使得结核杆菌对宿主细胞的侵袭、黏附增强，并长期在胞内潜伏感染[5]。PE_PGRS62蛋白是由MAG24同源基因(Rv3812)编码的细菌膜表面蛋白，但该蛋白具体的功能尚未见报道。

本研究采用PCR扩增M.bovisPE-PGRS62基因，利用pMV261穿梭表达载体，经电转染技术构建重组的耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(PE-PGRS62毒力基因)并表达PE-PGRS62蛋白，为进一步在蛋白水平上研究M.bovis侵入宿主细胞和在巨噬细胞长期存活的机理奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒与宿主菌 M.bovis菌株(C68.2)和耻垢分枝杆菌(ATCC607)由中国科学院疾病控制中心细菌研究所提供；pGEM-T easy载体购自Promega公司；pMV261穿梭表达载体和DH5α由本实验室保存。

1.2 主要试剂 BamHⅠ酶、EcoRⅠ酶和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；Middle Brook 7H9 Broch(M7H9)、Middle Brook ADC Enrichment、Middle Brook 7H10 Broch(M7H10)培养基和 Middle Brook ADC Enrichment均购自DIFCO公司；DNA凝胶回收试剂盒(EZ-10 Spin Colunm DNA Gel Extraction Kit)和质粒快速提取试剂盒(Plasmid Rapid Isolation Kit)均购自博大泰克公司；低分子量蛋白质标准Marker购自北京全式金生物技术有限公司；PVDF转移膜购自Gleman公司；……