吴欣伟，熊永忠，秦宏阳，曹宗喜，于俊勇，闫明菲，郭泗虎，张桂红*

(1.华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点开放实验室，广东 广州 510642；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的传染病，其病原为PRRS病毒(PRRSV)。2006年发生由PRRSV变异株引起的高热病给我国养猪业造成重大损失[1]。与经典株相比，PRRSV变异株的Nsp2蛋白缺失30个氨基酸。由此可见，PRRSV的变异对于PRRSV的毒力有重要影响。PRRSV基因组长约15 kb，有9个开放阅读框(ORF)。ORF1包括ORF1a和ORF1b，长约12 kb，占基因组的80%，编码病毒依赖RNA的RNA聚合酶。ORF2～ORF7编码病毒的结构蛋白，依次为：GP2、GP3、GP4、GP5、M和N。PRRSV通过产生6个亚基因组mRNA进行表达，这些亚基因组mRNA均具有5'NCR的共同前导序列，并且共有一个3'嵌套式结构[2]。

1997年Molenkamp等构建了第一例马动脉炎病毒(EAV)感染性cDNA克隆[3]。随后，Meulenberg等获得了PRRSV欧洲型代表株(LV株)的感染性cDNA克隆[4]。2003年，研究人员构建了美洲型代表株(VR-2332)的感染性克隆[5]。近几年，PRRSV反向遗传技术在我国的应用也越来越广泛[6]。本研究构建PRRSV-XH株的反向遗传系统，为其致病机理及新型减毒疫苗的研制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞及载体 美洲型缺失变异株PRRSV-XH、Marc-145细胞以及由pOK12改造具有多克隆位点的低拷贝载体pOKQ均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存；PGEM-T Easy Vector购自Promega公司。

1.2 主要试剂 SuperscriptTMⅡ反转录酶、platinum®pfx DNA聚合酶、RNaseH(RNA酶H)、RNase OUT RNA酶抑制剂、TRIzol®Reagent和脂质体DMRIE-C均购自Invitrogen公司；T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自NEB公司；蛋白酶K购自Merck公司；体外转录试剂盒mMESSAGE Mmachine HighYield Capped RNA Transcription kit购自Ambion公司；……