毕明慧 陈 坚*

上海市徐汇区中心医院老年病科1（200031） 复旦大学附属华山医院消化内科2

目前越来越多的研究证实具有抗氧化作用的中药单体（如丹参素、丹参酮、银杏黄酮、茶多酚等）对肿瘤治疗和预防具有良好的效果[1～3]。丹参素是一种酚性芳香酸类化合物，具有明显的抗炎、抗氧化作用。近年丹参素因其抗肿瘤活性而成为研究的热点，但其具体作用机制仍未完全阐明。正常细胞的增殖、分化和凋亡处于平衡，而肿瘤细胞能无限增殖、分化受阻、凋亡受抑[4]，故诱导凋亡是肿瘤治疗的重要途径。本研究通过采用不同浓度的丹参素体外干预人肝癌细胞株SMMC7721，旨在分析其对肝癌细胞增殖、凋亡的作用，并初步探讨作用机制。

材料与方法

一、细胞株、主要试剂和仪器

人肝癌细胞株SMMC7721购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

丹参素纯品（纯度>97%）购自复旦大学上海医学院天然药物化学教研室。取丹参素10 mg溶于5 ml PBS中后过滤除菌，4℃冰箱保存备用。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。RNA提取试剂盒、M-MLV逆转录酶购自Gibco公司。MTT试剂、Taq DNA聚合酶购自Promega（北京）生物技术有限公司。

美国Coulter公司EPICS Elite型流式细胞仪，日本JEOL公司JEM-1200EX透射电子显微镜，日本Olympus倒置相差显微镜，德国Biometra PCR仪。

二、实验方法

1.细胞培养：将SMMC7721细胞加入含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期肝癌细胞，常规胰酶法消化、收集细胞，计数板计数细胞浓度。

2.MTT法：按每孔1×104密度接种于96孔板，每孔200μl。12 h待细胞贴壁良好后，加入含丹参素的培养基，丹参素的终浓度分别为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L；以不加丹参素的培养基同等条件培养的细胞作为阴性对照组。培养24、48、72 h后，每孔加入 5 mg/ml MTT 溶液 20μl，37 ℃孵育4 h；弃上清液后加入 DMSO 150μl，振荡 10 min。上酶标仪检测各孔吸光度（A）值，检测波长为490 nm。计算细胞生长抑制率，抑制率（%）=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。

3.细胞形态：取对数生长期SMMC7721细胞，加入终浓度为40 mg/L的丹参素，置于5%CO2培养箱继续培养。每8 h倒置显微镜下观察细胞形态。24 h后结束培养，制备切片，透射电子显微镜下观察、拍片。

4.Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡：取对数生长期SMMC7721细胞，加入含丹参素的培养基，使其终浓度分别为 10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L，培养24 h后收集细胞待测；另取对数生长期SMMC7721细胞，加入终浓度为40 mg/L的丹参素，分别于培养 0、12、24、36、48 h 后检测细胞凋亡。上述药物干预均以不加丹参素的细胞作为对照。胰酶法消化收集贴壁细胞，2000 r/min离心5 min，弃上清，加入PBS重悬细胞，调整细胞浓度为 106/ml。 先后加入 10μl Annexin V-FITC 和 5μl PI，混匀后室温避光孵育15 min；上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm，检测波长为560 nm。

5.RT-PCR法检测p53 mRNA表达：取生长良好的SMMC7721细胞，加入含丹参素的培养基，使其终浓度分别为 0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L，24 h后收集细胞。以TRIzol一步法抽提总RNA，逆转录为cDNA，行PCR反应。各基因引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，p53 上 游 引 物 ：5’-GTG GCC TCT GTC ATC TTC CG-3’， 下 游 ：5’-CCG TCA CCA TCA GAG CAA CG-3’，片段长度291 bp；内参照β-actin上游引物：5’-ACC TTC AAC AAC CCA GCC ATG TAC G-3’，下游：5’-ACC TTC AAC AAC CCA GCC ATG TAC G-3’，片段长度 703 bp。PCR 反应体系 50μl，反应条件：94 ℃ 1 min；62 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min；30个循环，最后72℃10 min。PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，自动凝胶成像分析系统扫描记录图像，测定光密度（OD）值，目的基因mRNA表达以p53条带OD值与β-actin条带OD值的比值来表示。

三、统计学分析

应用SPSS 10.0统计软件。样本率的比较采用χ2检验；多样本均数比较用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞增殖

MTT法示，不同浓度的丹参素对SMMC7721细胞增殖均有抑制作用。10 mg/L丹参素即可抑制细胞生长，且随着浓度的升高以及干预时间的延长，抑制效应明显递增（P<0.05），即丹参素呈时间和剂量依赖性地抑制SMMC7721细胞增殖（见图1）。

图1 不同浓度丹参素作用24、48和72 h后对SMMC7721细胞的抑制

二、细胞形态

40 mg/L丹参素作用8 h后，SMMC7721细胞贴壁能力下降，部分细胞皱缩、变圆，折光性升高；作用16 h后，细胞之间失去紧密联接，小部分细胞漂浮；作用24 h后，大部分细胞漂浮，并可见细胞碎片。透射电子显微镜下示不同阶段的典型凋亡细胞以及破碎的坏死细胞。早期凋亡细胞可见染色质边集，在细胞核膜周边形成新月体形（见图2A）；随之染色体发生固缩，DNA片段化，显示电子密度增强的核碎片；细胞体积变小，胞质浓缩，但其内的细胞器仍保存较好；细胞膜保存完整，细胞膜表面微绒毛减少或消失；可见细胞膜芽生出泡现象。凋亡晚期可见核膜包裹的内含细胞器和细胞核碎片的凋亡小体（见图2B）。

图2 不同凋亡时期SMMC7721细胞的透射电子显微镜图（×2000）

三、细胞凋亡

流式细胞术示作用24 h后，丹参素呈剂量依赖性地诱导SMMC7721细胞凋亡和坏死，其中40 mg/L丹参素的促凋亡作用最为明显（见图3）。

图3 不同浓度丹参素作用24 h后SMMC7721细胞凋亡率和坏死率比较

40 mg/L丹参素作用SMMC7721细胞不同时间后，呈时间依赖性地诱导凋亡和坏死（见图4），其中48 h时的作用最为明显，SMMC7721细胞几乎全部凋亡或坏死，且以凋亡为主要效应。

四、p53 mRNA表达

RT-PCR法示随着丹参素干预SMMC7721细胞浓度的升高，p53 mRNA表达明显上调（见图5）。说明丹参素诱导SMMC7721细胞凋亡与p53基因表达有密切关系。

图4 40 mg/L丹参素作用不同时间后SMMC7721细胞凋亡率和坏死率比较

图5 不同浓度丹参素作用后p53 mRNA表达的PCR电泳图

讨 论

丹参素是一种新型的酚性芳香酸类化合物，早在1991年，Wu等[5]将分离自丹参氯仿提取物的15种成分作用于人鼻咽癌细胞株KB、人宫颈癌细胞株HeLa、人结肠癌细胞株COLO 205和人喉癌细胞株Hep-2，发现其对癌细胞均有不同程度的杀伤作用。杨华等[6]发现丹参素可通过阻滞细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡而抑制胃癌MGC803细胞生长，且细胞中cyclin B1蛋白表达显著下调，而caspase-3和caspase-6活性显著升高。胆固醇是真核细胞生长分裂过程中必不可少的物质，方杰[7]发现丹参素能通过阻断肿瘤细胞胆固醇合成而抑制乳腺癌细胞生长。但郭自强等[8]的研究发现丹参素能通过抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞凋亡而产生心肌保护作用；庞鹤等[9]证实丹参素可抑制缺氧/缺糖损伤所致的线粒体膜电位和活性的降低，从而具有稳定线粒体膜电位的作用，抑制神经细胞发生凋亡。由此可见，丹参素对不同类型的细胞凋亡具有相反作用，这可能由于肿瘤细胞的能量代谢和信号通路与正常细胞不同所致[10]。本研究中，丹参素可呈时间和剂量依赖性地抑制肝癌SMMC7721细胞的增殖，并时间和剂量依赖性地诱导SMMC7721细胞凋亡，与透射电子显微镜的结果一致。

肿瘤细胞的增殖和转化过程均涉及氧自由基的增多；自由基可作为第二信使调节细胞蛋白激酶、转录因子活性、早期基因表达等，从而促进细胞增殖和转化[11]。申亮等[1]应用量子化学法计算丹参素的O-H键解离焓和电离势，并以此为理论指标评价其清除自由基的活性。结果显示丹参素具有较高的清除自由基的活性。刘珊林等[12]证实丹参素能清除SMMC7721细胞的内源性活性氧，减少H2O2的产生，通过阻断活性氧上调的PKB以及c-fos/cjun信号通路，从而抑制SMMC7721细胞的生长。

p53是一种抗癌基因，其高表达可诱导细胞凋亡。对正常细胞而言，p53所介导的细胞凋亡是对某些DNA损伤因子（如放射线、化疗药物等）的保护反应。p53的活化可通过诱导p21WAF1/CIP1基因表达增加，使细胞阻滞于G1/S期[13,14]；如DNA未得到及时修复，p53继续诱导凋亡相关基因Bax表达增加[15]，使抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax之间的平衡失调，最终导致细胞凋亡[13,16]。本研究RT-PCR结果显示，随着丹参素浓度增强，p53基因表达显著增强，说明丹参素干预可上调野生型p53表达。p53表达增强是丹参素促进细胞凋亡的潜在机制之一。但细胞凋亡过程存在一个复杂的调控网络，由多种凋亡相关基因或信号通路参与并相互影响，因此有待进一步深入研究各信号途径之间的相互联系和作用。

综上所述，丹参素在一定浓度范围内呈时间和剂量依赖性地诱导肝癌细胞坏死和凋亡，其机制可能与p53表达上调有关。目前对丹参素的研究尚处于药理观察和临床前期阶段，今后应重点对其单体进一步纯化和结构改造，同时深入研究其抗肿瘤作用的分子机制，以便能将丹参素等中药单体开发成为一种新型的高效低毒的抗肿瘤药物。

1 申亮,纪洪芳,柴建国,等.对九种天然产物清除自由基活性的理论评价.生物物理学报,2005,21 (5):332-338.

2 Zhang LJ,Chen L,Lu Y,et al.Danshensu has anti-tumor activity in B16F10 melanoma by inhibiting angiogenesis and tumor cell invasion.Eur J Pharmacol,2010,643(2-3):195-201.

3 陈坚,钟良,钱立平,等.丹参酮ⅡA诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及机制.复旦学报(医学版),2007,34(1):57-61,65.

4 Fabregat I.Dysregulation of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells.World J Gastroenterol,2009,15(5):513-520.

5 Wu WL,Chang WL,Chen CF.Cytotoxic activities of tanshinones against human carcinoma cell lines.Am J Chin Med,1991,19(3-4):207-216.

6 杨华,程金建.丹参素对胃癌MGC803细胞周期的影响及凋亡诱导作用.山东医药,2010,50(36):28-30.

7 方杰.丹参素对乳腺癌MCF细胞株的作用.中国老年医学杂志,2003,23(3):168-169.

8 郭自强,王硕仁,朱陵群,等.丹参素和川芎嗪对血管紧张素Ⅱ诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响.中西医结合心脑血管病杂志,2006,4(6):494-495.

9 庞鹤,朱陵群,张文生,等.丹参素对缺氧/缺糖损伤的神经细胞线粒体膜电位和凋亡的影响.中华中医药杂志,2006,21(6):329-332.

10 施冬云,刘珊林,李浩然,等.缺氧应激对肝癌细胞代谢信号通路的调节作用.生物化学与生物物理进展,2006,33(9):869-876.

11 Souici AC,Mirkovitch J,Hausel P,et al.Transition mutation in codon 248 of the p53 tumor suppressor gene induced by reactive oxygen species and a nitric oxidereleasing compound.Carcinogenesis,2000,21 (2):281-287.

12 刘珊林,刘冠中,程建,等.蛋白激酶对活性氧调节7721人肝癌细胞生长的影响.生物化学与生物物理学报,2002,34(1):67-72.

13 Kuo PL, Lin CC. Green tea constituent (-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits Hep G2 cell proliferation and induces apoptosis through p53-dependent and Fas-mediated pathways.J Biomed Sci,2003,10(2):219-227.

14 Punj V,Chakrabarty AM.Redox proteins in mammalian celldeath:an evolutionarily conserved function in mitochondria and prokaryotes.Cell Microbiol,2003,5(4):225-231.

15 Eissing T,Waldherr S,Allgöwer F,et al.Response to bistability in apoptosis:roles ofbax,bcl-2,and mitochondrial permeability transition pores.Biophys J,2007,92(9):3332-3344.

16 Kim CH,Yoo YM.Melatonin induces apoptotic cell death via p53 in LNCaP cells.Korean JPhysiol Pharmacol,2010,14(6):365-369.