张丽莉 曹 俊 沈卫东 朱 浩 沈永华 邹晓平

南京大学医学院附属鼓楼医院消化科（210008）

hMLH1是DNA错配修复（MMR）系统的重要成员，可在DNA复制过程中识别和修复错配碱基[1,2]，以维持遗传物质的完整性和稳定性。目前已明确MMR基因突变是遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC）的遗传学基础，且在散发性结直肠癌（CRC）的发病中亦起一定作用[3]。本研究通过对hMLH1启动子区-93G/A基因多态性进行检测，并与CRC患者的临床病理资料行相关性分析，旨在探讨其与CRC发生、发展的关系。

材料与方法

一、患者来源

连续收集2008年1月～2010年10月南京大学医学院附属鼓楼医院的住院CRC患者312例，其中男193例，女119例，年龄16～92岁，平均（61.5±15.3）岁。所有患者均排除家族性结直肠癌、肛门癌、转移癌等其他肿瘤。284例患者病理诊断和肿瘤分期明确，其余28例无详细临床病理资料。纳入同期无肿瘤家族史和其他遗传性疾病史的体检患者300例作为正常对照，其中男169例，女131例，年龄 24～79 岁，平均（56.6±12.7）岁。 两组间性别构成、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。

本研究经鼓楼医院伦理委员会同意，所有入选者均知情同意。

二、方法

1.主要试剂和仪器：DNA提取试剂盒购自Promega公司，Real-time PCR Master Mix购自Nustar公司。TaqMan MGB探针和引物均由ABI公司合成。hMLH1-93G/A正义引物：5’-ACC CAG CAA CCC ACA GAG T-3’，反义引物：5’-GTC TAG ATG CTC AAC GGA AGT G-3’；TaqMan 探针 G：5’-FAM-TCT TCC TTC AGC TGT AG-MGB-3’，TaqMan探针 A：5’-HEX-TTC TTC CTT TAG CTG TAG CMGB-3’。Applied Biosystems 7500型实时荧光定量PCR系统购自ABI公司。

2.TaqMan MGB探针荧光定量PCR检测基因多态性：按试剂盒说明抽提外周血白细胞DNA，水化后－80℃保存。PCR反应体系10μl，反应条件：95℃预变性 10 min，95℃变性 15 s，60℃退火、延伸共50 s，共50个循环，实时荧光定量PCR系统行结果分析。

三、统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件，直接计数法计算各基因型和等位基因频率，组间比较采用χ2检验。Logistic回归分析CRC风险，并计算优势比（OR）和95%CI。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、hMLH1-93G/A基因多态性

两组hMLH1启动子区-93G/A基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡（P＝0.099，P＝0.414）（见表 1）。

二、CRC患者危险因素分析

两组GG、GA、AA基因型频率差异无统计学意义（χ2=3.036，P=0.219）。

CRC患者亚组分析示Dukes A/B亚组的GG、GA基因型频率明显高于C/D亚组，AA基因型频率明显低于C/D亚组；淋巴结转移亚组的AA基因型频率明显高于无淋巴结转移亚组，GG、GA基因型频率明显低于无淋巴结转移亚组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。CRC患者按性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤部位、肿瘤最大径、分化程度、远处转移等行分层分析，各基因型频率差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表 2）。

进一步对不同Dukes分期和有无淋巴结转移的CRC患者行等位基因分析，结果示Dukes A/B期患者的A等位基因频率明显低于C/D期患者，G等位基因频率明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。淋巴结转移者A等位基因频率明显高于无淋巴结转移者，G等位基因频率明显降低，差异亦有统计学意义（P＜0.05）（见表 3）。

讨 论

CRC高发于西方国家，近年亚洲地区CRC发病率亦不断上升，我国的CRC发病率已接近西方国家，且有年轻化趋势[4,5]。

CRC的病因主要包括遗传和环境两大因素，前者包括基因缺失、突变、甲基化、组蛋白修饰、各基因型的人群分布差异等[6]。近年，某些特定基因型人群分布差异与肿瘤易感性相关研究，已成为肿瘤遗传学研究的新内容。环境因素如肥胖、高脂饮食、亚硝酸盐摄入过多、吸烟、饮酒等，对后天基因改变的作用尚未得到证实[7]。近年有研究表明hMLH1基因在CRC发生中起重要作用，提示hMLH1基因多态性可能对CRC的诊断有重要价值，但国内相关研究还较少[8]。

表1 两组hMLH1启动子区-93G/A基因多态性结果分析 n（%）

表2 CRC患者危险因素分析 n（%）

表3 不同Dukes分期和淋巴结转移患者等位基因分析 n（%）

MMR基因hMLH1-93G/A位于核心启动子区，该区域存在两个转录结合位点，即NF-IL6和GT-ⅡB[9]。不同人群的hMLH1-93G/A基因型分布存在显著差异，欧美人群以GG基因型为主[10]，本研究结果示正常对照组和CRC组的GA基因型比例高于其他基因型，与Park等[11]的研究结果一致。hMLH1-93G/A不同基因型可能通过影响其转录和表达，从而影响DNA的修复。Arita等[12]通过体内足迹法证实该基因位点与其蛋白结合能力相关，不同基因型的蛋白结合能力不同，由此可通过改变表观遗传学状态以调节hMLH1基因的表达。

hMLH1-93G/A基因多态性证实与乳腺癌、肺癌、结直肠息肉等相关。韩国人群研究[12]发现，AA基因型者罹患鳞状细胞肺癌的风险明显增加。GG基因型与韩国女性乳腺癌发病相关[13]。Yu等[14]在美国人群中的研究发现，长期吸烟者的hMLH1-93 AA和AG基因型者罹患直肠息肉、腺瘤的风险增加。现有观点认为肺癌等恶性肿瘤的MLH1-93A基因型与其甲基化有关[15]，转录位点特异性遏制物可能通过招募DNA甲基转移酶致基因甲基化、基因沉默[16,17]。上述研究提示hMLH1-93A/G基因多态性可能对CRC有修饰作用。但本研究结果示hMLH1-93G/A基因多态性与CRC的发生无关，与Campbell等[10]的研究结果一致。进一步对CRC患者行分层分析示，Dukes C/D期患者的A等位基因和AA基因型频率高于A/B期患者，淋巴结转移者的A等位基因和AA基因型频率亦高于无淋巴结转移者，由此推断hMLH1-93 A等位基因和AA基因型者肿瘤进展的风险增加，可能与启动子区基因多态性影响hMLH1的转录和表达，从而影响DNA修复有关。

肿瘤的发生受基因、环境等因素影响，并非某一特定基因所致。因此基因多态性研究尚不能从根本上解释肿瘤的发生，仅能提高对肿瘤发生的认识。本研究结果表明汉族人群hMLH1-93G/A基因多态性与CRC易感性无关，但A等位基因和AA基因型者发生淋巴结转移的风险增加，提示hMLH1-93 A等位基因和AA基因型是CRC进展的危险因素，但尚需大样本研究予以验证。此外，本研究结果尚提示hMLH1基因多态性与肿瘤侵袭力相关，但目前尚无相关研究，可进一步通过体外实验予以证实。

1 de la Chapelle A.Genetic predisposition to colorectal cancer.Nat Rev Cancer,2004,4(10):769-780.

2 Kunkel TA,Erie DA.DNA mismatch repair.Annu Rev Biochem,2005,74:681-710.

3 魏广辉,赵博,王振军.单链构象多态性分析和变性高效液相色谱分析技术检测hMLH1和hMSH2基因突变的比较.中华胃肠外科杂志,2008,11(5):462-464.

4 Fengju S,Guanglin W,Kexin C.Incidence of colon cancer in Tianjin,China,1981-2000.Asia Pac J Public Health,2005,17:22-25.

5 Zheng S,Cai SR.Colorectal cancer epidemiology and prevention study in china.Chinese-German J Clin Oncol,2003,2(2):72-75.

6 Marth G,Yeh R,Minton M,et al.Single-nucleotide polymorphisms in the public domain:how useful are they?Nat Genet,2001,27(4):371-372.

7 Alexander DD,Cushing CA,Lowe KA,et al.Metaanalysis of animal fat or animal protein intake and colorectal cancer.Am J Clin Nutr,2009,89 (5):1402-1409.

8 Mei Q,Yan HL,Ding FX,et al.Single-nucleotide polymorphisms of mismatch repair genes in healthy Chinese individuals and sporadic colorectalcancer patients.Cancer Genet Cytogenet,2006,171(1):17-23.

9 Ito E,Yanagisawa Y,Iwahashi Y,et al.A core promoter and a frequent single-nucleotide polymorphism of the mismatch repair gene hMLH1.Biochem Biophys Res Commun,1999,256(3):488-494.

10 Campbell PT,Curtin K,Ulrich CM,et al.Mismatch repair polymorphisms and risk of colon cancer,tumour microsatellite instability and interactions with lifestyle factors.Gut,2009,58(5):661-667.

11 Park SH,Lee GY,Jeon HS,etal.-93G-->A polymorphism of hMLH1 and risk of primary lung cancer.Int J Cancer,2004,112(4):678-682.

12 Arita M,Zhong X,Min Z,et al.Multiple sites required for expression in 5’-flanking region of the hMLH1 gene.Gene,2003,306:57-65.

13 Lee KM,Choi JY,Kang C,et al.Genetic polymorphisms of selected DNA repair genes,estrogen and progesterone receptor status,and breast cancer risk.Clin Cancer Res,2005,11(12):4620-4626.

14 Yu JH,Bigler J,Whitton J,et al.Mismatch repair polymorphisms and colorectal polyps:hMLH1-93G>A variant modifies risk associated with smoking.Am J Gastroenterol,2006,101(6):1313-1319.

15 Mei M,Liu D,Dong S,et al.The MLH1-93 promoter variant influences gene expression.Cancer Epidemiol,2010,34(1):93-95.

16 Brenner C,Deplus R,Didelot C,et al.Myc represses transcription through recruitment of DNA methyltransferase corepressor.EMBO J,2005,24(2):336-346.

17 Brenner C,Fuks F.DNA methyltransferases:facts,clues,mysteries.Curr Top Microbiol Immunol,2006,301:45-66.