王晓玲,乐 健,洪战英,范国荣

(1.第二军医大学药学院药物分析学教研室,上海 200433;2.福建中医药大学药学院,福州 350108;3.上海市食品药品检验所,上海 201203)

疼痛(pain)是由实际的或潜在的组织损伤所引起的不愉快感觉[1],也是一种预警机制,防止机体遭受压迫或进一步损伤,是当今困扰人类健康的严重问题之一。疼痛研究已经成为当前神经科学研究的热点问题。

目前,临床上对多种急慢性疼痛多采取西药治疗为主。其中一类为阿片类镇痛药,如哌替啶、吗啡、可待因等,另一类为非阿片类镇痛药,如复方阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬等。这两类镇痛药虽然疗效得到肯定,但长期使用会引起成瘾性、消化性溃疡等不良反应。因此,寻找副作用和依赖性小的止痛中药已成为新趋势。本文总结了近年来中药镇痛研究中常用的动物疼痛模型,进一步探讨了疼痛相关物质及其常用的测定方法,现综述如下。

1 常见动物疼痛模型

1.1 物理刺激致痛模型

1.1.1 热板法[2]热板法是一个经典的筛选镇痛药的实验,其原理是将雌性小鼠放在(55±0.5)℃的热板上,小鼠受热刺激后可出现舔足反应,测定热痛反应时间(痛阈);镇痛药可提高痛阈,延长热痛反应时间。该模型对组织损伤最小,动物可反复利用,且简便易行。如辛晓明等[3]采用热板致痛法研究杜仲多糖对小鼠的镇痛作用,结果表明其对热板致痛有一定的抑制作用。

1.1.2 甩尾法 本法也属于热刺激致痛模型,是一种初级脊髓反射。具体方法是将动物适当固定后,令尾巴自然下垂,待动物安静后,将尾巴浸于48℃热水中,记录从开始浸入到逃离水面的时间作为伤害性感受阈,以15 s为最长刺激时间上限。该方法的优点是通过观察药物对不同水温刺激致痛反应的影响,可初步评价药物镇痛作用的强度。如粘芙蓉等[4]用小鼠热水甩尾法研究中药穿山龙镇痛作用,结果表明穿山龙水煎液对模型小鼠显示出较好的镇痛效应。

1.2 化学刺激致痛模型

1.2.1 扭体法 此模型是用某种化学刺激性物质(如乙酸、酒石酸锑钾、缓激肽等)注入小鼠腹腔后刺激脏层和壁层腹腔,致使小鼠出现扭体反应。该模型已成为常规药物筛选方法,实验中的作用强度与临床镇痛效果具有明显的相关性。如刘少明等[5]采用小鼠腹腔注射乙酸造成疼痛模型,研究抗骨质增生巴布剂(为新型中西药复方制剂,方中主要含有生川乌、麝香等中药的提取物及盐酸利多卡因等药物)的镇痛作用。结果表明其能显著降低小鼠扭体次数,具有显著的镇痛作用。

1.2.2 炎症(炎性反应)致痛模型 炎症性疼痛是指由创伤、细菌或病毒感染以及外科手术引起的外周组织损伤导致炎症时所引起的疼痛。研究中建立的经典模型包括4%甲醛溶液(福尔马林)致痛模型[6]、角叉菜胶炎症模型[7]、佐剂关节炎模型[8]等,其中佐剂关节炎模型以福氏佐剂(Freund's adjuvant)作为致炎物质。根据佐剂注射部位的不同可分为:多发性佐剂关节炎、单发性佐剂关节周围炎和局限性单发性佐剂关节腔炎模型[9]。佐剂关节炎模型与人的类风湿性关节炎很相似,造模特异性高,假阳性率低,是慢性疼痛模型最为理想的模型之一。如谭煌英等[10]通过大鼠佐剂致炎造模,研究康莱特注射液(主要成分为薏苡仁油)镇痛作用及其机制,结果表明该药能显著提高大鼠痛阈值,具有镇痛作用。

1.3 神经系统损害引起的疼痛 神经病理性疼痛是外伤或疾患导致的外周神经、脊髓背根、脊髓或脑内某些区域的病损所致的疼痛。大多数神经病理性疼痛的动物模型是人为地在动物的感觉传导通道上制造损伤造成的。损伤的部位可包括外周神经干、脊神经、背根及脊髓[9]。神经病理性疼痛模型可分为中枢性和外周性两大类。如杜兰芳等[11]采用外周神经损伤和炎症所致的大鼠慢性背根节压迫神经病痛模型,研究延胡索乙素(l-THP)对大鼠外周的镇痛作用。结果表明,延胡索乙素可抑制慢性压迫背根节神经元异位自发放电,并且具有剂量依赖性,这一结果提示延胡索乙素抑制自发放电可能是延胡索抑制周围神经系统疼痛的机制之一。

2 中药镇痛相关物质及其测定

中医理论认为疼痛主要受气、血、寒、热等因素的影响[12],并随着机体内外环境的变化而变化。因此,研究中药镇痛作用机制是以中医药理论结合现代医学方法进行研究探索的。目前,越来越多的中药镇痛研究采用先进的分析技术对疼痛相关物质,如与疼痛发生机制关系较为密切的单胺类神经递质、与神经通路密切相关的即刻早期基因(c-fos),以及与外周、中枢不同水平的痛觉调节中起重要作用的一氧化氮等,进行检测分析。所采用的手段包括色谱法、计算机分析技术、免疫组化和原位杂交法等(见表1)。

表1 疼痛相关物质的测定Table 1 Determination of pain-related substances

2.1 单胺类神经递质 单胺类神经递质是一类调节机体生理活动的重要物质,包括去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-H T)等物质。这些物质在组织中的含量变化是反映神经递质生物合成、释放、摄取、失活等过程的生化指标[19]。它们既是神经递质,又能直接致痛,在疼痛过程中参与了致痛和镇痛两方面的作用。单胺类神经递质的检测方法主要以HPLC-电化学法为主。此外,化学荧光法也是经典而灵敏的检测手段。已有文献报道在甲醛致痛模型、乙酸疼痛模型,以及福氏佐剂致痛模型中测定单胺类神经递质。

陈敏敏等[13]用HPLC-电化学法测定大鼠脑内和血液中NE、5-H T、DA的含量,发现癌痛平可以降低甲醛致痛模型大鼠5-HT、DA、NE水平,推测其镇痛作用机制可能与其影响NE、5-H T、DA含量有关。

2.2 一氧化氮(NO) NO是迄今为止在体内发现的第一个气体信息分子,已成为生物学领域研究的热点和前沿之一。NO作为一种神经递质和信息传递分子,在外周、中枢以及脊髓不同水平的痛觉调节中发挥重要作用。中枢神经系统内源性NO水平的降低表现出一定的镇痛效应;而在外周痛觉的调控中,认为抑制NO的合成可产生镇痛作用[20]。文献报道多通过建立甲醛致痛模型、福氏完全佐剂致痛模型及乙酸致痛模型,采用硝酸还原酶法检测模型动物血清中NO,进行药物镇痛研究。

袁晓琴等[14]用硝酸还原酶法测定乙酸致痛小鼠NO含量,结果表明细辛乙酸乙酯提取物可显著降低模型小鼠脑组织和血清中NO的含量,提示细辛的镇痛与降低NO含量有关。

2.3 c-fos原癌基因表达 c-f os原癌基因是一种即刻早期基因,耦联细胞外信息与细胞内靶基因的转录,被称为核内“第三信使(third messenger)”。大量研究表明,c-fos基因参与细胞的正常生长、分化过程,调节细胞内信息的传递过程,而且其在中枢神经系统内的表达与痛觉调控密切相关[21]。c-fos作为伤害性刺激的标志物,研究其与痛觉调控的关系有助于解决痛觉的形成及调控机制、针刺镇痛原理,以及评价药物镇痛效能等难题。研究中大多建立甲醛疼痛模型,采用免疫组化染色法观察c-fos基因表达。

陈荣明等[15]建立两种致炎疼痛模型(甲醛、胰蛋白酶),观察复方南星止痛膏对两种模型大鼠足跖肿胀压痛的影响及脊髓中 c-f os的表达。结果表明,复方南星止痛膏能减少模型大鼠c-f os阳性神经元在脊髓背角浅层内的表达,从而阻断痛觉信息传导通路,这可能是其发挥镇痛作用的机制之一。

2.4 谷氨酸 机体内谷氨酸是由谷氨酰胺脱氨基或经三羧酸循环产生的,它是兴奋性神经递质中最重要的一种兴奋性氨基酸,在学习、记忆等生理过程和中枢疼痛感觉传导方面起关键性作用。以谷氨酸为媒介的神经冲动传递,诱发痛觉中枢产生高度兴奋性是慢性疼痛形成的重要基础[22]。检测谷氨酸常用的方法包括HPLC法和比色法。

彭媛等[16]研究复方银杏胶囊的镇痛作用及其机制,采用比色法测定乙酸疼痛模型小鼠脑组织中谷氨酸的含量。结果表明,复方银杏胶囊具有良好的镇痛效应,其镇痛作用可能与抑制脑组织中谷氨酸的释放及钙离子内流有关。

2.5 降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP) CGRP是一种含有37个氨基酸的神经肽,广泛分布于人和哺乳动物的中枢和外周神经系统感觉神经C-纤维末梢及组织器官中。有研究表明,痛觉过敏的形成与脊髓伤害性信息传递通路中 CGRP的释放及其受体的激活有关[23]。CGRP的检测以放射免疫分析法为主。

许国敏等[17]研究红毛五加总苷灌胃对大鼠体内疼痛介质的影响,分别采用双缩脲法和放射免疫法测定甲醛致痛模型大鼠血清及脑组织的NO和CGRP的变化。结果推测红毛五加总苷的镇痛作用可能不影响体内CGRP水平,而与NO变化有关。

2.6 P物质(substance P) P物质是一种神经肽,广泛分布于中枢和外周神经系统,在各种组织中呈现出多种生物效应。脊髓P物质既可传递痛觉信息又有镇痛作用,在脊髓水平参与痛觉的调控[24]。免疫组化法是P物质的主要检测方法。

杨明会等[18]观察天元克痛方对甲醛疼痛模型大鼠痛反应的影响,采用免疫组化法测定大鼠脊髓背角P物质含量。结果表明,天元克痛方能减少脊髓背角神经元对传入的伤害性刺激的反应,可能是其发挥镇痛作用的途径之一。

3 小结和展望

目前,止痛中药已成为现代药物研究的热点,中药镇痛研究中建立的动物疼痛模型能在不同程度上模拟人类各种疼痛的特点。在实际应用中,实验者需针对研究目的去选择或建立实用的疼痛模型。当然,动物疼痛模型的可复制性以及可靠性也还有待进一步完善。此外,目前模型的建立多采用单纯外界伤害性刺激的方法,尚不能全面反映疾病内在的实际情况,今后如能根据中医对疼痛“不通则痛”病理机制的认识,建立符合中医理论的中医“证候”疼痛模型,将有利于深入揭示中药镇痛机制。

中医药理论对痛症的病因病机以及治疗均积累了丰富的经验,但由于疼痛产生的复杂性和中药成分的复杂性,使得明确中药镇痛的作用机制还需要更加深入的探索。不过,随着科技进步与创新,以及中药现代化的发展,高效、安全的止痛药研究一定会取得重大突破。

[1] 周秋雯,徐建国.慢性疼痛动物模型的研究进展[J].医学研究生学报,2008,21(6):638-642.Zhou QiuWen,Xu JianGuo.Animal models of chronic pain[J].J Med Postgraduate,2008,21(6):638-642.Chinese with abstract in English.

[2] Bomholt S F,Mikkelsen J D,Blackburn-Munro G.Antinociceptive effects of the antidepressants amitriptyline,duloxetine,mirtazapine and citalopram in animal models of acute,persistent and neuropathic pain[J].Neuropharmacology,2005,48(2):252-263.

[3] 辛晓明,王大伟,王远丽,等.杜仲多糖镇痛作用研究[J].现代中西医结合杂志,2009,18(5):487-488.Xin XiaoMing,Wang DaWei,Wang YuanLi,et al.Study on analgesic effect of Eucommia ulmoides Oliv Polysaccharides[J].Mod J Integr Tradit Chin West Med,2009,18(5):487-488.Chinese with abstract in English.

[4] 粘芙蓉,辛晓林.中药穿山龙镇痛实验研究[J].中华中医药学刊,2009,27(8):1644-1645.Nian FuRong,Xin XiaoLin.Study on analgesic tests of Dioscoreanipponica Makino[J].Chin Arch Tradit Chin M ed,2009,27(8):1644-1645.Chinese with abstract in English.

[5] 刘少明,陆松伟,杨建刚.抗骨质增生巴布剂镇痛抗炎作用研究[J].药学服务与研究,2007,7(3):206-208.Liu ShaoMing,Lu SongWei,Yang JianGang.Experimental studies on anti-inflammatory and analgesic effects of the Kangguzhizengsheng cataplasm[J].Pharm Care Res,2007,7(3):206-208.Chinese with abstract in English.

[6] Clavelou P,Dallel R,Orliaguet T,et al.The orofacial formalin test in rats:effects of different formalin concentrations[J].Pain,1995,62(3):295-301.

[7] Wilson H D,Wilson J R,Fuchs P N.Hyperbaric oxygen treatment decreases inflammation and mechanical hypersensitivity in an animal model of inflammatory pain[J].Brain Res,2006,1098(1):126-128.

[8] Goudet C,Chapuy E,Alloui A,et al.GroupⅢmetabotropic glutamate receptors inhibit hyperalgesia in animal models of inflammation and neuropathic pain[J].Pain,2008,137(1):112-124.

[9] 张玉玲.疼痛实验动物模型研究概况[J].承德医学院学报,2009,26(2):195-198.Zhang YuLing.Study on animal models of pain[J].J Chengde Med Coll,2009,26(2):195-198.Chinese.

[10] 谭煌英,李 园,于莉莉,等.康莱特对大鼠的镇痛作用及其对促炎细胞因子的影响[J].中国中西医结合外科杂志,2007,13(2):152-155.Tan HuangYing,Li Yuan,Yu LiLi,et al.Analgesic action of Kanglaite injection and its effects on levels of TNF-αand IL-Iβ in inflamed skin in a rat model of persistent inflammatory pain[J].Chin Surg J Integr Tradit West Med,2007,13(2):152-155.Chinese with abstract in English.

[11] 杜兰芳,杜永平,徐 晖,等.延胡索乙素对大鼠外周镇痛作用的实验研究[J].中国中医急症,2009,18(5):781-783.Du LanFang,Du YongPing,Xu Hui,et al.The study of L-tetrahydropalmatine on peripheral analgesic in rats[J].J Emerg T radit Chin Med,2009,18(5):781-783.Chinese with abstract in English.

[12] 张维文.《内经》疼痛机制的研究[J].中医药学刊,2004,22(6):1092-1094.Zhang WeiWen.Research on analgesic mechanism in〈Canon of medicine〉[J].Chin Arch Tradit Chin Med,2004,22(6):1092-1094.Chinese.

[13] 陈敏敏,程海波,张 颖,等.癌痛平对甲醛致痛模型大鼠单胺类神经递质的影响[J].中药药理与临床,2008,24(5):60-63.Chen MinMin,Cheng HaiBo,Zhang Ying,et al.Effect of Aitongping on norepinephrine,serotonin,dopamine contents in blood and brain tissues in formalin induced pain model rats[J].Pharmacol Clin T radit Chin Med,2008,24(5):60-63.Chinese with abstract in English.

[14] 袁晓琴,孙莲芬,郑 进.细辛的镇痛作用部位及机制研究[J].上海中医药杂志,2009,43(5):72-75.Yuan XiaoQin,Sun LianFen,Zheng Jin.Analgesic components of asarum and its mechanisms[J].Shanghai J Tradit Chin Med,2009,43(5):72-75.Chinese with abstract in English.

[15] 陈荣明,姜 淼,殷书梅,等.复方南星止痛膏对甲醛等致炎性疼痛模型大鼠止痛作用及c-fos表达的影响[J].世界中西医结合杂志,2008,3(8):454-456.Chen RongMing,Jiang Miao,Yin ShuMei,et al.Impact of compound Nanxing pain paste on analgesia and the expression of c-fos in model rats with formaldehyde-induced inflammatory pain[J].World J Integr T radit West Med,2008,3(8):454-456.Chinese with abstract in English.

[16] 彭 媛,顾振伦,张慧灵,等.复方银杏胶囊镇痛作用及其机制的实验研究[J].中国野生植物资源,2005,24(3):37-39.Peng Yuan,Gu ZhenLun,Zhang HuiLing,et al.Studies on analgesic effect and mechanism of compound Ginkg o capsule[J].Chin Wild Plant Resources,2005,24(3):37-39.Chinese with abstract in English.

[17] 许国敏,郑加嘉,黄东亮,等.红毛五加总苷对大鼠体内疼痛介质的影响[J].深圳中西医结合杂志,2008,18(6):329-333.Xu GuoMin,Zheng JiaJia,Huang DongLiang,et al.Effects of glucosides of Acanthopanax giraldii on pain mediators in rats invivo[J].Shenzhen J Integ r T radit West Med,2008,18(6):329-333.Chinese with abstract in English.

[18] 杨明会,张海燕,刘 毅.天元克痛方对福尔马林模型大鼠痛行为和脊髓背角c-fos表达及P物质含量的影响[J].中国中西医结合杂志,2004,24(11):992-995.Yang Ming Hui,Zhang HaiYan,Liu Yi.Effect of Tianyuan Ketong Recipe on the pain behavior,c-f os expression and P substance contents in dorsal horn of spinal cord in fo rmalin induced pain model rats[J].Chin J Integr Tradit West Med,2004,24(11):992-995.Chinese with abstract in English.

[19] 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1991:162-163.Xu ShuYun,Bian RuLian,Chen Xiu.Pharmacological experiment methodology[M].2nd ed.Beijing:People's Health Press,1992:162-163.Chinese.

[20] 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2002:882.Xu ShuYun,Bian RuLian,Chen Xiu,et al.Pharmacological ex periment methodology[M].3rd ed.Beijing:People's Health Press,2002:882.Chinese.

[21] 马加海,徐礼鲜.c-fos原癌基因与痛觉调控[J].国外医学◦麻醉学与复苏分册,2000,21(3):141-143.M a JiaHai,Xu LiXian.c-fos proto-oncogene and pain regulation[J].Foreign Med(Anesthesiol Resuscit Sec),21(3):141-143.Chinese.

[22] 黄云巧,杨建明,陈国强.谷氨酸与慢性疼痛[J].昆明医学院学报,2007,28(2B):117-121.Huang YunQiao,Yang JianMing,Chen GuoQiang.Glutamate and chronic pain[J].J Kunming M ed Coll,2007,28(2B):117-121.Chinese with abstract in English.

[23] 张晓英,杨国栋,佘永华,等.疼痛模型大鼠下丘脑和脊髓CG RP的含量变化[J].川北医学院学报,2008,23(2):109-111.Zhang XiaoYing,Yang GuoDong,She Yong Hua,et al.The change of content of calcitonin gene-related peptide(CGRP)in hypothalamus and spinal cord of pain model rats[J].J North Sichuan Med Coll,2008,23(2):109-111.Chinese with abstract in English.

[24] 朱建军.脊髓P物质在电针镇痛中作用的研究进展[J].南通大学学报(医学版),2007,27(3):228-230.Zhu JianJun.Advances in research on role of spinal P substance in electroacupuncture analgesia[J].J Nantong Univ(Med Sci),2007,27(3):228-230.Chinese.