赵媛媛，肖 龙，朱 莺，胡建东，江 敏，胡枫江，魏文松，李会芹

(1.河南农业大学机电工程学院，河南郑州450002;2.河南职业技术学院，河南郑州450046;3.浙江省标准化研究院，浙江 杭州310006;4.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州450002)

光学表面等离子共振(Surface plasomon resonance，SPR)生物传感技术是一种多用途的分析平台，广泛应用于非标记、非破坏性、在线监测生物分子动态反应，已在农业、食品安全监测、药物筛选、临床医学诊断及环境监测等领域得到越来越广泛的应用［1～3］.在光学SPR 检测系统中，来自光源和检测系统噪声以及环境温度、机械振动等带来的信号抖动都会使理想信号受到噪声和失真的干扰.因此，为了提高仪器的检测性能，使其具有高灵敏度和高稳定性，不但要优化仪器系统硬件，还要选择相应的信号处理方法，最佳的数据处理方法可有效的降低测量过程中随机噪声和系统不理想所造成的影响，可以大大提高测量系统的准确度和数据的精度［4～6］.数据分析方法能够使光学表面等离子共振生物传感系统得到一些高精度的信息，用来推算实际生物分子动态反应过程中所发生的现象，从而用来引导新的SPR传感系统的设计以达到最大分辨率［7～9］.通常，从数据采集系统采集到的数据是被测目标的某些物理量经过传感器的转换，再经过放大或衰减等环节之后所呈现出来的一种数据形式.由于设备性能的不理想，以及外界干扰、噪声的影响，都会在采集到的数据中引入一定的噪声或干扰，因而数据处理的一个重要任务就是要采取各种方法最大限度地消除这些噪声，以尽可能提供数据的精确度［10，11］.目前 SPR的数据处理方法主要有质心跟踪法、一阶导数零点法、多次测量求平均等处理方法.质心追踪法是以SPR曲线的最小点为中心，采用内插值的方法，分别向左、右选择相同数量的点，从而确定要计算的数据的起点和终点，再采用一阶矩的公式计算［12，13］.该方法的优点在于可以减少噪音信号对仪器的干扰，且可以应用于非对称的SPR曲线，但对于线阵CCD来说，各个像素间是相互独立的，这种方法限制了非扫描分析仪的动态范围，增大了系统的误差.一阶导数零点法是通过寻找数据的一阶导数零点位置来确定最低点，由于最低点处的信号强度较小，受噪声影响较大，影响准确性.多次测量求平均可以有效的抑制噪声，但却会降低灵敏度.作者提出了多项式拟合和质心法相结合的处理方法.首先对采集到的数据进行滑动平均滤波处理，计算基线来确定处理数据的范围，在这个范围内利用多项式拟合对SPR曲线进行处理，然后通过质心法计算最低点值所对应的像素位点，这种方法在一定程度上提高了数据处理的精度和灵敏度.

1 非扫描光学生物传感器

非扫描式光学SPR生物传感器的结构示意图如图1所示，该光学SPR生物传感器主要由光源、光学SPR芯片和CCD光电检测器3部分组成.光源由一字线型激光器(波长650 nm)和光学P偏振片组成，光学SPR芯片由端面蒸镀有50 nm金膜的光学直角棱镜和微流通池组成，CCD光电检测器由2 048个像素的线阵CCD和信号采集器组成.

非扫描性角度调制型光学SPR生物传感器，入射光波长不变，将一字线型激光器发出的激光光束以一定角度穿过直角棱镜入射到棱镜与金膜的界面，光线从该界面产生全反射，CCD数据采集器会接收从棱镜端面反射回来的光强信号，并通过USB接口传给上位机以实时获得光学SPR共振响应曲线.

图1 光学SPR生物传感器结构Fig.1 A schematic structure of an optical SPR biosensor

图1中激光束通过P偏振片照射到直角棱镜，在棱镜的端面形成一字线形光谱.试验时，在金膜上压上微流通池，其通道与金膜的长边平行，打开激光器，观察一字线形光谱，把微流通池的通道完全覆盖光谱.用蠕动泵控制流通池中样品的进出，进样后，调整激光器位置，入射光照射到CCD上时形成直线型光斑，由于全反射现象，必然有某一角度的入射光，图1中所示粗光线，是发生光学表面等离子波共振时光谱位置，在CCD检测器上表现为光强最低点，上位机显示该共振曲线.

2 共振光谱信号处理算法

由于光学SPR芯片灵敏度很高，获得的信号或多或少的会受到外界信号的干扰，因此在采集SPR光学信号时，要对采集到的信号进行预处理，此阶段多采用滤波处理，本研究采用的是滑动平均值滤波的方法，该方法主要用于采样速度较慢或要求数据计算较高的实时系统，因此适宜用于SPR采集系统.每条光学SPR曲线反应的是N个像素所对应的光强，然后分析完整的SPR曲线来确定样品层的厚度，样品层厚度的改变会引起反射光谱衰减特征的改变，从而光学SPR曲线不同.光学响应值表示为{y［j］}，j=1，2，…，2 048，像素位点为x={xi，i=0，…，N}.设取样 1 组测量数据，在上位机中设置N个取样点的存储空间，取样值则为y1，y2，y3，…，yN，N 作为滑动窗口，如果把数组 N+1处的值作为第j点的响应值，那么j点的平均值pj=，因此上位机显示的SPR共振曲线的每点响应点都是滑动平均后的值.

然后采用多项式拟合方法对最低点附近区域进行数据拟合，然后利用质心法求解SPR曲线的最低点.给定数据序列(xi，yi)，i=1，2，…，m［16］，以二次项拟合为例.

拟合函数与数据序列的均方误差

由多元函数的极值原理，Q(a0，a1，a2)的极小值满足

整理得二次多项式函数拟合的法方程

非扫描式光学SPR生物传感器获得是二维数据，线阵CCD的每个像素是独立存在的，像素位点和光学响应值一一对应，并都为已知量，因此可以计算出系数a0，a1，a2的值，多项式的阶数越高，计算就越复杂.研究采用的CCD为2 048个像素，数据量大，可设定适当的曲线拟合范围以屏蔽掉测量分析时没有用到的位点数据，减小计算量.光学SPR共振信号的最低点是通过质心法来求解获得的，质心法是一种几何形心求解的物理方法.在求解对称的SPR曲线的最低点位点时，首先需要确定1条基线，用基线和SPR曲线交点范围内的数据点作为检测点，基线确定方法的公式为

式中:Pb表示基线值，Pmax和Pmin分别表示SPR信号响应值的最大值和最小值.

为了计算方便基线通常选取SPR曲线共振峰深度的半值左右.它与SPR曲线的交点确定需要计算数据位点的起点和终点，计算SPR曲线的一阶矩的值.

式中:Ci表示所求SPR曲线与基线相交所得图形的几何形心，m，n分别表示基线与SPR曲线的2个交点，作为积分区间，i表示SPR曲线的相位点，Pi表示SPR信号的最低响应值所对应的像素位点.因此，采用一阶距法计算几何形心时，Pb值的选择非常重要，如果Pb值选取较小，虽然并不能改变共振峰的位置.但是，通常减小Pb会减少计算点的个数，从而增大噪声对检测结果的影响.

3 试验方法与数据处理

3.1 试验方法

试验采用的试剂为不同体积分数的乙醇，把试验平台放置于暗箱中，减小外来光线和电磁信号干扰.试验步骤如下:(1)固定一字线型激光器和线阵CCD，使入射至每个像素位点的入射光束和反射光束的光程相加相等，流通池完全覆盖金膜，用蠕动泵抽取少量的乙醇溶液.(2)旋转调整激光器，使激光光束通过全反射后照到CCD表面，此时通过上位机观察获得的光学SPR曲线.(3)观察光学SPR曲线是否出现最低点，即要寻找共振角，如无则继续调整激光器或CCD的位置，直至获得理想的光学SPR共振曲线为止.通过对不同体积分数的乙醇溶液的试验来验证表面等离子生物分析仪的灵敏度.

首先依次流入微流通池体积分数13%，14%，16%，17%，18%，19%的乙醇溶液分别试验，观察上位机上的光学SPR共振曲线，待每个体积分数的乙醇溶液流过微流通池至信号稳定再读数，其中每完成1个体积分数的乙醇溶液测定后均用去离子水冲洗金膜表面进行再生，使传感器能够连续测量.

3.2 数据处理

依照上述试验方法，可以获得乙醇溶液的光学SPR共振曲线.体积分数为13%的乙醇溶液光学SPR共振曲线见图2.其他体积分数的乙醇溶液采用相同的方法，求出了其最低点值所对应的像素位点.

图2 体积分数为13%的乙醇溶液光学SPR共振响应数据点和拟合曲线Fig.2 The optical SPR original data points and fitting curve of ethanol at volume fraction 13%

图2中的数据点为经滑动平均值滤波后实时显示的数据，实线表示的是在一定范围内对数据进行多项式拟合后的结果.以体积分数为13%的乙醇溶液为例，根据公式(5)可设定基线约为2 500，此时基线与SPR实测光学响应共振曲线的交点分别为450和1 400，在这个区间内对响应曲线进行多项式拟合，由于像素位点和光学响应值为已知量，因此根据公式(3)和(4)可计算出多项式的系数，进而得到拟合曲线公式，并在此区间内，利用质心法求取拟合曲线的最低点值所对应的像素位点.其他体积分数的乙醇溶液采用相同的算法，最后求得的体积分数为 13%，14%，16%，17%，18%，19%的乙醇溶液所对应共振像素位点值分别为862.05，856.10，842.21，821.57，814.70，808.00.

光学生物传感器的灵敏度是指被测乙醇体积分数的变化相对于光学响应最低值的变化，灵敏度分析可以反映生物传感器的性能，也反映了光学芯片的敏感度，由得到的共振像素位点值可以看出，光学响应最低点所对应像素位点值(OP)随着乙醇体积分数(V)的增加而减小.

图3中的数据点表示的是不同体积分数乙醇溶液所对应的共振像素位点，光学响应最低点所对应像素位点值与不同体积分数乙醇溶液的关系见图3.从图3可以看出，二者之间存在一定的线性关系，对二者进行线性拟合，其方程为OP=989.24－959.60V，相关系数为 －0.985 2，灵敏度可达959.60(像素位置/体积分数).由此看出两者之间存在较好的线性关系，从而证明多项式拟合算法在处理非扫描式光学SPR生物传感器数据上具有一定的优越性.

图3 乙醇溶液光学响应最低点对应像素位点与其体积分数之间的关系Fig.3 The pixel position corresponds optical resonance dip-value as a function of ethanol volume fraction

4 结论

本研究提出了一种多项式拟合算法对自行设计的一种新型的光学SPR生物传感器进行数据处理，首先采用滑动平均值法对数据进行滤波，然后采用最小二乘法求得多项式拟合系数，用来求解SPR传感系统参数.该方法可以快速实现光学SPR生物传感器的共振最低点的求解.通过对体积分数分别为13%，14%，16%，17%，18%，19%的乙醇溶液进行检测，用多项式拟合对一定区间内的数据进行处理，再用质心法计算拟合曲线的最低点值所对应的像素位点.试验结果表明，该方法可以使光学SPR生物传感器获得灵敏度可达959.60，为光学SPR的广泛应用以及大量测量数据的处理提供了依据.

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