陈海英，杨 文，张 艳

(1.海口市琼山区人民医院，海南 海口 571100;2.海南医学院 热带医学与检验医学院 实验中心，海南 海口 570100;3.海南省干部疗养院，海南 海口 571100)

糖尿病时糖脂代谢紊乱，血管紧张素Ⅱ释放增加，均可刺激活性氧(ROS)产生而损伤血管内膜，引起内皮细胞凋亡，进而促进血管病变的发生[1]。牛磺酸是一种含硫氨基酸，在眼、血管和胆囊中具有解毒和抗氧化作用，在心血管方面也有广泛作用[2]。本研究观察牛磺酸对高糖培养下诱导大鼠血管内皮细胞氧化应激与凋亡的影响，为防治糖尿病血管并发症提供实验依据。

1 材料

牛磺酸，北京世纪维他生物技术有限公司;胰蛋白酶，Sigma 公司;2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2-DCFDA)，Santa Cruz公司;DMEM培养基、小牛血清，Gibco公司。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，南京建成生物工程研究所。

健康Wistar大鼠，清洁级，12周龄，广东省医学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(粤)2003-0002。

2 方法

2.1 细胞培养

处死大鼠，取胸主动脉，去除血管外膜及脂肪组织，组织块法培养内皮细胞，在37℃，5%CO2，含10%小牛血清的DMEM培养基中培养，待细胞达80%融合状态，用0.25%胰酶消化传代，第4代细胞用于实验。

2.2 细胞分组

取对数生长期的第4代内皮细胞，调整细胞终浓度为2×105/mL，置于6孔板中，每孔10 mL，在含10%小牛血清的DMEM培养基中加入葡萄糖，使其终浓度为30 mmol/L，于5%CO2、37℃培养箱中继续培养。将细胞分成 5组，分别为 0，2.5，5，10，20 mmol/L牛磺酸共培养24 h，每组3个复孔。

2.3 大鼠血管内皮细胞氧化应激

流式细胞仪测定内皮细胞内ROS含量。细胞与牛磺酸作用24 h后，加入终浓度为10 μmol/L的H2-DCFDA，置于CO2恒温培养箱，60 min后吸去培养液。……