佘美华，侯洪杰，胡小波，尹卫东

(南华大学 生命科学学院 生物化学与分子生物学系，湖南 衡阳 421001)

褪黑素(melatonin，MLT)是松果体分泌的一种神经内分泌激素，研究证实它参与了体内物质和能量的代谢。研究显示MLT从多个方面对糖尿病及其慢性并发症提供保护作用，可能参与了调节机体葡萄糖稳态。本课题以3T3-L1脂肪细胞作为研究对象，采用游离脂肪酸(FFA，棕榈酸)来诱导成熟的3T3-L1脂肪细胞发生胰岛素抵抗，测定细胞葡萄糖摄取能力以及MLT的作用。

1 材料

MLT(纯度＞99%)由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供;3T3-L1前体脂肪细胞株购自中科院上海细胞生物所细胞中心;DMEM低糖培养基购自Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州赛乐生物科技有限公司。

2 方法

2.1 3T3-L1脂肪细胞的培养和诱导

细胞生长于含10%FBS、1×105u/mL青霉素和10 mg/mL链霉素的DMEM低糖培养基中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养。细胞经传代和收集，待细胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、1 μmol/L 地塞米松、5 μg/mL胰岛素、含10%FBS的DMEM培养48 h，再换以含5 μg/mL胰岛素的培养液再培养96 h，中间换液一次，随后以含10%FBS的DMEM培养液继续培养，油红O染色后显微镜下观察。诱导分化8～12 d的3T3-L1细胞90%多呈脂肪细胞表型，可用于研究。

2.2 MLT对FFA诱导的胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

将诱导成功的脂肪细胞用FFA(300 μmol/L棕榈酸)或不用 FFA处理6 h，然后用50，100，200 nmol/L胰岛素诱导进行葡萄糖摄取的研究。液体闪烁仪测定各组细胞的葡萄糖摄取能力[1]。根据抑制程度选择最佳胰岛素作用浓度。

FFA处理脂肪细胞6 h，处理结束前30 min加入胰岛素或(和)MLT(10 nmol/L)处理共孵育至结束，测定各组细胞的葡萄糖摄取能力。……