林晓思，许 健，王生育，颜江华

(厦门大学医学院抗癌研究中心，福建 厦门 361000)

双特异抗体可以有效的将效应细胞富集到靶细胞周围，增强对靶细胞的杀伤，因而双特异抗体介导的免疫细胞治疗是一种很有前景的肿瘤治疗手段。CD5是一种泛T细胞(pan T Cell)表面标记，在双特异性抗体介导T细胞对肿瘤靶向治疗的过程中，CD5可以取代CD3和FcR作为双特异抗体在T细胞表面的结合点，并消除这两者和配体交联后引发的副作用[1-2]。另一方面在 T淋巴细胞瘤中由于CD5的表达上调，因此CD5也被选作治疗靶点[3-4]。本文拟采用基因工程手段，构建 scFv anti-CD5/pET22b(+)重组质粒，原核表达重组蛋白。为构建以scFv anti-CD5为构件的双特异抗体以及免疫偶联物提供物质前提，并为其应用于肿瘤的免疫治疗提供基础。

1 材料

菌种 E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α 和质粒pET22 b(+)，Novagen 公司;细胞株 EC304，南京凯基生物技术有限公司;细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，长春藤生物技术有限公司;Pfu DNA聚合酶，天根生物技术有限公司;NcoⅠ和XhoⅠ内切酶、T4DNA连接酶，NEB公司;Ni-NTA agarose，GE公司;HRP标记抗His-tag兔多克隆抗体，北京康维世纪生物技术有限公司;异硫氰酸酯荧光素(FITC)，Amresco公司。引物由上海生工合成。

EPICS XL流式细胞仪，美国 Beckman-Coulter公司。

2 方法

2.1 重组质粒的构建

2.1.1 基因序列与引物设计 从NCBI Genbank里查到DNA序列M90468和M90467，扣除前面66 bp的pelB信号肽序列后得到的即是anti-CD5的重链可变区VH和轻链可变区VL的序列。在VH和VL之间插入linker-(G4S)3编码序列，在VH的5'添加NcoⅠ酶切位点，在VL的3'端添加XhoⅠ酶切位点，并在整个基因两端添加保护碱基序列，并通过E.coli高频率简并密码子取代原始序列中的稀有密码子，设计出的目的基因scFv anti-CD5序列(共计741 bp)，合成10条拼接引物F1-R10，以及一对扩增引物 F11和 R11(表1)。……