王建亭， 林 楠 (首都医科大学附属北京朝阳医院耳鼻咽喉头颈外科，首都医科大学耳鼻喉科学院，首都医科大学耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室， 北京 100020)

泛素－蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是近年来发现的细胞中重要的非溶酶体蛋白降解途径，在各种不同的癌蛋白或者转录调节因子的降解方面发挥重要作用。泛素连接酶Pirh2是泛素连接酶E3家族中的一个新成员，其参与了泛素－蛋白酶体途径，可通过调控抑癌基因p53的表达，进而调节肿瘤细胞的发生和发展。目前，Pirh2在喉癌组织中表达及其与临床病理特征之间的关系尚未见报道，本研究采用免疫组织化学方法检测Pirh2蛋白在喉癌组织中的表达水平，探讨Pirh2蛋白表达与喉鳞状细胞癌(LSCC)临床分期、组织学分级和颈部淋巴结转移等临床病理特征之间的关系，探讨Pirh2在喉鳞状细胞癌发生和发展中所起的作用，为喉癌的诊治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 临床资料 随机收集2004－2009年我院有完整临床资料的原发性喉鳞状细胞癌手术切除标本存档蜡块57例(喉癌组)，其中16例同时保留有癌旁相临的安全缘以外的正常喉黏膜组织(对照组)。57例患者中，男47例，女10例;年龄33－72岁，平均(46.56 ±1.89)岁;声门上型19 例，声门型35例，声门下型3例;按UICC2002年TNM分期方案进行分期，其中Ⅰ期30例，Ⅱ期16例，Ⅲ期7例，Ⅳ期4例;组织学分级，其中 G133例，G217例，G37例;经病理证实有淋巴结转移12例，无淋巴结转移45例。所有病例术前均未行放、化疗。病理诊断均为LSCC。全部患者均有完整的随访资料。

1.2 试剂 鼠抗人单克隆Pirh2抗体(sc-166293)购自美国Santa Cruz公司，鼠SP免疫组织化学染色试剂盒(SP-9002)购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学检测Pirh2蛋白表达 取存档蜡块，4 μm厚切片脱蜡入水，梯度乙醇水化，3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性，微波修复抗原，5% －10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，甩出血清，滴加1∶500一抗，37℃孵育1 h，滴加生物素标记二抗，室温孵育1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，显色剂显色(DAB)，苏木精复染，中性树脂封片，显微镜下观察结果。以PBS液代替一抗为阴性对照，以已知Pirh2阳性切片为阳性对照。结果判定:阳性表达主要为胞质呈棕黄色着色。所有切片采用双盲法阅片，每张切片任选5个高倍视野，每个视野计数100个细胞，共计500个细胞，计算阳性细胞所占比例，并据此对染色结果分级，Pirh2阳性率﹤25%为阴性(－)，pirh2阳性率 25% －50%为阳性(+)，pirh2阳性率≥50%为强阳性(++)。

1.4 统计学分析 采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计分析，组间比较采用χ2检验，Fisher确切概率法，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测 Pirh2蛋白表达结果Pirh2蛋白在喉癌组和对照组的阳性表达主要定位于胞质，呈棕黄色(见图1)，Pirh2蛋白在喉癌组及对照组中阳性表达率分别为77.19%(44/57)和18.75%(3/16)，差异具有统计学意义(P ＜0.01)。

图1 Pirh2蛋白在喉癌组织中表达 (SP，×200)Fig 1 Pirh2 protein expression in larynx cancer tissues(SP，×200)

2.2 Pirh2蛋白表达与喉癌临床病理学特征之间的关系 Pirh2蛋白阳性表达率与喉癌患者年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期及淋巴结转移均无关，与喉癌组织学分级有关，见表1。

表1 Pirh2在喉癌组织中表达与临床病理学特征之间的关系 例(%)Tab 1 Relationship between expression of Pirh2 and clinicopathological features in larynx cancer cases(%)

3 讨论

喉癌是耳鼻咽喉头颈外科较常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年增长趋势，随着分子生物学技术的发展，原癌基因的激活和抑癌基因的失活已被认为是肿瘤发生、发展的一个重要环节。泛素－蛋白酶体途径主要经细胞内的蛋白酶体降解泛素化的蛋白质，由泛素激活酶E1、泛素转移酶E2和泛素连接酶E3共同完成，参与了细胞的信号转导、有丝分裂和分化，是蛋白质降解的重要途径，已经成为肿瘤学研究中的新热点。泛素－蛋白酶体途径中只有泛素连接酶E3识别底物具有特异性，所以目前的研究大多集中在E3上。泛素连接酶Pirh2是2003年发现的一个分子量约为30 kD的蛋白质，是泛素连接酶E3家族中的一个新成员，由261个氨基酸组成，其中第145－186位是其环指结构域所在，即泛素连接酶的活性中心。Pirh2因含一个环指结构域而具有E3的功能，可以泛素化降解抑癌基因p53，参与肿瘤的形成，已经被定义为癌基因［1，2］。

Pirh2在恶性肿瘤的主要生物学行为与其所特有的分子结构锌指H2环状区域密切相关，p53作为肿瘤抑制因子在整个恶性肿瘤的发生发展过程中起到非常重要的作用，Pirh2由p53诱生，Pirh2通过自身相互作用和泛素介导的蛋白质降解的作用负反馈调节p53，控制着p53的水平，进而调节肿瘤细胞发生和发展。Pirh2与肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等关系的相关研究已有报道［3－7］，而 Pirh2与喉癌关系的相关研究尚未见报道。本研究发现，喉癌组Pirh2阳性表达率为77.19%(44/57)，显著高于对照组Pirh2阳性表达率18.75%(3/16)，其差异具有统计学意义(P＜0.01)。提示Pirh2在喉癌的发生、发展中起着一定作用。本研究中，在喉癌不同组织学分级中，G1与G2+G3级比较，Pirh2阳性表达率差异有统计学意义(P＜0.05)，提示Pirh2过表达与喉癌的恶性程度有关。本研究还显示，Pirh2阳性表达与喉癌患者的年龄、性别、临床分型(肿瘤部位)、临床 TNM分期和淋巴结转移均无关，提示Pirh2过表达只是喉癌发生、发展过程中一个较早期的重要分子事件。

本研究结果表明，Pirh2可能与喉癌的发生和发展有关，Pirh2在喉癌组织中高表达，Pirh2高表达与喉癌的组织学分级有关，检测Pirh2表达可能为判断喉癌的恶性程度提供理论依据。Pirh2作为一种癌基因，如能阻断其高表达，或许对指导喉癌治疗有一定价值。

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