牛 利， 许瑞龄 (山西医科大学病理生理学教研室， 太原 030001)

在各型急慢性肝损伤、酒精性肝病及急性肝衰竭过程中TNF-α作为炎性细胞因子扮演了重要的角色，临床实践中发现重型肝炎患者血清TNF-α水平明显升高［1］。TNF-α是引起肝损伤的重要促炎细胞因子，可由LPS诱导枯否细胞产生，在急性肝损伤发病过程中起着非常重要的作用。近年来，热休克蛋白(heat shock protein，HSP)在适应性细胞保护中的作用日益受到重视。据报道，亚砷酸钠(sodium arsenite，SA)可诱导肝脏产生热休克反应，使组织和细胞处于应激状态，导致热休克蛋白特别是HSP70的产生［2］。细胞受到轻度刺激后，HSP70可在转录和翻译水平调整相关蛋白的合成，改变细胞的代谢和功能，以减轻有害刺激所致的损伤。为此本实验利用腹腔注射SA诱导肝脏HSP70表达，通过HSP70对肝损伤中TNF-α的影响来探讨HSP70保护肝脏的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物，试剂及仪器 雄性昆明种小鼠70只，体重(25±2.9)g，由山西医科大学实验动物中心提供。内毒素(LPS)购自Sigma公司;亚砷酸钠:购自湖南水口山矿务局衡阳实业总公司;TNF-α放免试剂盒:购自北京解放军总医院;Re-24型SORALL低温超速离心机:美国Du Pont公司;TNF-α和HSP70羊抗鼠多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;辣根过氧化酶标记的兔抗羊二抗购自北京中杉生物技术公司。Marker购自美国 Amershammacio Biotch公司;PVDF膜购自美国Milipore公司。DYY-Ⅲ8B型稳压稳流定时电泳仪、DYY-Ⅲ7B型转移电泳仪:北京六一仪器厂。UV-2102型分光光度计:尼龙柯(上海)仪器有限公司。

1.2 动物分组和处理 雄性昆明种小鼠70只，习服饲养5 d，实验前1 d下午禁食，饮水不限，将小鼠随机分为:对照组(n=10)，0.9%NaCl 0.2 ml/只腹腔注射;LPS组(n=30)，LPS溶于生理盐水，剂量为5 mg/kg，腹腔注射一次;SA预处理组(n=30)，SA溶于无菌生理盐水，8 mg/kg于前一晚8:00腹腔注射一次，12 h后腹腔注射LPS，剂量和处理与LPS组相同。各组动物分别于处理后0.5 h(n=10)、1.5 h(n=10)、6 h(n=10)，在戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉下经眼内眦静脉采血、开腹取肝。肝组织用铝薄纸包装，液氮速冻后－70℃冰箱冷冻保存。

1.3 方法 用Western blot方法检测肝脏HSP70，TNF-α蛋白的表达;按照改良金氏法测定血浆ALT活性;用放射免疫法测定肝匀浆中TNF-α的含量。1.3.1 各组取冻存的肝组织200 mg，置液氮研碎，转入匀浆器中加入RIPA(用前加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)裂解液后匀浆，12 500×g，4℃离心20 min，取上清。肝组织细胞核蛋白按Essani方法提取。Bradford法测定蛋白含量。取等量蛋白(20 μg)加样，以4%浓缩胶，10%分离胶(测HSP70)和15%分离胶(测 TNF-α)行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)补充其浓度。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转印迹至PVDF膜，转膜过夜后经5%脱脂奶粉于室温封闭2 h，1×TBST缓冲液漂洗(3次，10 min/次)，然后分别加入1∶1 000的相应蛋白抗体，4℃摇荡过夜。次日用1×TBST漂洗3次后，再加入1∶2 000的针对一抗种属的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下摇荡2 h，1×TBST漂洗3次。然后在暗室内将膜置入ECL发光液1－2 min，用PE保鲜膜包盖PVDF膜，置于X线胶片下曝光、显影和定影。将定影后的X线片图像用扫描仪转化为数码图像，用 Quantity One(Bio-Rad)4.52软件，进行图像分析处理，获取图像光密度值(A)。

1.3.2 取6 h的内眦静脉血液离心后取血清100 μl，加入谷丙基质液 0.5 ml，置于37 ℃水浴30 min，后每管加入2，4－二硝基甲苯0.5 ml，37℃水浴20 min 加入 0.4 mol/L NaOH 5.0 ml混匀于520 nm 光电比色。

1.3.3 取冻存的1.5 h的肝组织100 mg加入 pH 7.4的磷酸盐缓冲液1 ml，匀浆机上搅碎。按TNF-α试剂盒说明书测定肝匀浆中TNF-α含量。

1.4 统计学分析 使用SPSS11.5统计软件，数值均以±s表示。One-way ANOVA进行多样本均数的比较，当P＜0.05时，采用LSD-t检验进行均数的两两比较(α =0.05)。

2 结果

LPS注射后0.5 h肝脏HSP70达到表达高峰，随着时间推移其表达逐渐减弱;而经SA预处理动物肝脏HSP70表达在上述3个时间点均较LPS组明显增强(P ＜0.05，见图 1、表1)。LPS组 TNF-α表达在3个时间点较对照组明显升高，而经SA预处理动物肝脏TNF-α表达在0.5 h和1.5 h虽较对照组高，但较LPS组明显减少(P＜0.05，见图2和表1)。SA预处理 TNF-α在6 h仍较 LPS组减少，其差异具有统计学意义(P＜0.05，见图2和表1)。

图1 小鼠肝脏HSP70的Western blot分析Fig 1 The expression of HSP70 in the liver of mice by Western blot

图2 小鼠肝脏TNF-α的Western blot分析Fig 2 The expression of TNF-α in the liver of mice by Western blot

表1 小鼠肝脏HSP70，TNF-α在不同肝损伤时间的表达结果Tab 1 The expression of HSP70 and TNF-α in the liver of mice at different time points after LPS-induced hepatic injury

LPS所致肝损伤组血浆ALT活性较对照组显著升高(P＜0.01)，而SA预处理组的ALT活性明显低于肝损伤组，其差异具有统计学意义(P＜0.01)。肝损伤组TNF-α水平明显高于对照组(P＜0.05)，SA组TNF-α水平虽高于对照组但却明显低于肝损伤组，差异具有统计学意义(P＜0.05，见表2)。

表2 各组ALT，TNF-α的含量比较Tab 2 The contents of ALT and TNF-α in different groups at 6 h

3 讨论

HSP是生物体在不利环境因素刺激下应激合成的一组特殊的蛋白质。它可以使细胞进入保护状态，特别是HSP70的产生可使细胞对致死性的损伤产生抵抗。诱导型HSP70的主要功能是发挥分子伴侣作用［3］及调控炎症因子释放作用［4］，可以保护细胞线粒体免遭活性氧化产物的攻击、抑制促炎症因子如TNF-α、IL-1等诱导的呼吸爆发［5］。细胞受到轻度刺激后，HSP70可在转录和翻译水平调整相关蛋白的合成，改变细胞的代谢和功能，以减轻有害刺激所致的损伤，HSP70参与此项调节过程，并可增强细胞对损害的耐受力。本实验用SA预处理诱导HSP70的合成来抵御LPS诱导的肝损伤。实验结果表明SA 预处理组HSP的含量在0.5 h，1.5 h，6 h三个时间点都明显高于LPS组(P＜0.05)，说明SA预处理可增加HSP70的表达。在急性肝损伤时，血浆ALT水平的升高在2 h后12 h前［6］，因此本实验选择测定肝损伤后6 h血浆ALT的水平。结果显示，肝损伤组ALT明显高于对照组及SA预处理组，说明增加HSP70的表达对肝损伤具有保护意义。

肿瘤坏死因子是具有多种生物活性的多肽调节因子，适量的TNF-α可调节机体的免疫功能，对维持机体的正常稳定状态及抵御各种致病因子有着重要的作用。而TNF-α的异常分泌又可作为机体炎症、损伤和休克的重要炎性介质，参与诱导细胞的凋亡过程。肝脏富含TNF-α受体，且具有高亲和力，是TNF-α的重要靶点，对TNF-α的毒性具有高度敏感性，它与肝脏炎症活动性及肝细胞坏死程度密切相关［7］。TNF-α可通过激活磷酯酶 A，引起炎细胞的聚集、渗出和浸润，产生严重的炎性损伤;也可诱导肝细胞产生自由基和脂质过氧化反应;另外，它还可通过诱导中性粒细胞和单核巨噬细胞的活化，产生更多的氧自由基，形成恶性循环，加重肝损伤。热应激或亚砷酸盐预处理肺泡巨噬细胞，可明显减少巨噬细胞受LPS刺激后分泌的TNF-α水平，而且可能是通过诱导HSP70以翻译水平来调节LPS刺激肺泡巨噬细胞分泌的 TNF-α［8］。本实验在 0.5 h，1.5 h，6 h三个时间点SA预处理组TNF-α的水平均显著低于损伤组(P＜0.05);而急性肝损伤时，TNF-α的分泌高峰在1 h后［6］，因此本文选择测定损伤后1.5 h肝匀浆中TNF-α的含量，结果显示，肝损伤组TNF-α的含量明显高于对照组，而SA预处理组肝匀浆TNF-α水平明显低于肝损伤组(P＜0.05)，提示SA诱导肝脏HSP70表达可减少肝损伤中TNF-α的释放，以减轻TNF-α对肝脏的损伤作用。

综上所述，SA预处理可诱导肝脏产生HSP70，在LPS诱导的急性肝损伤中，可通过降低TNF-α的含量来达到减轻肝脏炎症反应，减弱肝损伤的程度。

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