闫丽隽， 赵 欣， 邵淑丽 (山西省肿瘤医院妇科， 太原 030013;通讯作者，E-mail:YLJ7576@sina.com)

子宫颈癌是全球妇女最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家尤为常见，是妇科三大恶性肿瘤之一，其死亡率占中国女性癌症的第2位［1，2］。在子宫颈癌的组织学分型中鳞状细胞癌(包括角化型43.3%，非角化型 29.1%，小细胞型 10.9%)就占83.3%。鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)作为鳞癌相关抗原，其血清学检测已被广泛用于临床子宫颈癌的辅助诊断，且具有器官特异性较高和良性疾患特异性较低的特点，但值得注意的是在体外收集标本和测量过程中存在影响因素，如皮肤污染和涎液可能强烈影响SCC-Ag的水平，在患一些良性疾病如肺结核、支气管囊肿、皮肤湿疹、牛皮癣等时，SCC-Ag也可以升高。Buyru等［3］发现检测癌症患者外周血中SCCA mRNA可以改善常规检查的较低诊断率，我们用TaqMan探针real-time-PCR方法检测子宫颈鳞状细胞癌组织中SCCA1 mRNA和SCCA2 mRNA的表达并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 病例来源 选择2006－01～2007－01山西省肿瘤医院首诊的子宫颈鳞癌患者60例，采用FIGO1985年临床分期标准分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例(取门诊首诊患者活检组织)，年龄27－66岁，平均年龄53.93岁。收集手术切除的子宫颈鳞癌新鲜癌组织标本，取30例因子宫肌瘤作全子宫切除的正常子宫颈组织作对照(均经病理证实)。

1.2 试剂 Trizol液，氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC水，M-MLV cDNA Kit(上海生物工程技术服务有限公司);琼脂糖(AgaroseⅡ，加拿大 BBI公司)，扩增试剂盒TagMan universal master mix reactions(Applied Biosystems，Foster City，CA)美国 Taq-Man公司;基因表达试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)美国TaqMan公司。

1.3 方法

1.3.1 总RNA提取 采用Trizol试剂提取子宫颈组织中总RNA，取1 μl经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.3.2 cDNA合成 应用M-MLV反转录酶(上海生工)制备cDNA，以Oligo-p(dT)为引物，按说明书操作合成cDNA第一链。操作步骤:模板RNA 2 μl，Oligo-p(dT)引物 1 μl，RNase-free H2O，定容至12 μl，70 ℃ 5 s。再加入 5 × 反应液 4 μl，RNase 灭活酶 1 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl，37 ℃ 5 s。加M-MLV反转录酶1 μl 37℃ 60 s，70℃ 10 s终体积为 20 μl，结束反应，加 RNase-free H2O 至 200 μl，－80℃冷冻保存。

1.3.3 RT-PCR 在 ABI Prism 7000(ABI公司，美国)实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增，总反应体系为 25 μl，含 TaqMan 总反应体系 12.5 μl，上游和下游引物各 1.25 μl，TaqMan Probe RNasefree H2O 6.25 μl，cDNA 5 μl。反应条件为:2 min 50℃，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 1 min，共50 个循环，所有测定为双管重复，以GAPDH为内参照基因。引物设计见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 结果判定 在每次实验中系统浓度稀释被用来测定扩增效率。SCCA1和 SCCA2基因相对于GAPDH的相对表达计算如下:相对表达率用公式△Ct=Ct目的基因－ Ct内参照基因，表示其表达的相对拷贝数，△Ct值越低，实际拷贝数越高。

2 结果

2.1 SCCA1和SCCA2 mRNA在子宫颈癌的表达SCCA2 mRNA在子宫颈鳞癌组织与正常子宫颈组织中的表达差异有统计学意义(P＜0.001)。SCCA2 mRNA在宫颈癌组织中表达较正常子宫颈组织中△Ct值低，其实际含量则高。而SCCA1 mRNA在两种组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

在癌组织中SCCA2 mRNA的表达高于SCCA1 mRNA，经配对t检验分析，差异有统计学意义(t=－11.347，P ＜0.001)。

表2 SCCA1和SCCA2 mRNA在宫颈鳞癌组织和正常宫颈组织中的表达Tab 2 Expression of SCCA1 and SCCA2 mRNA in tissues of cervical squamous cell carcinoma and normal cervix

2.2 子宫颈癌组织中SCCA mRNA表达与子宫颈鳞癌患者临床病理特征的关系 有淋巴结转移的宫颈鳞癌组织中SCCA2 mRNA的表达较无淋巴转移的癌组织高，差异有统计学意义(t=2.853，P＜0.01)，而SCCA1 mRNA的表达则无统计学差异。

不同年龄及不同病理分级中SCCA2 mRNA及SCCA1 mRNA的表达差异均无统计学意义。

经单因素方差分析，不同临床分期的患者癌组织中SCCA2 mRNA的表达差异有统计学意义(F=8.313，P=0.002)，经 LSD 法两两比较，三组间两两比较差异均有统计学意义，然后进行Sperman秩相关分析，结果显示 r= －0.616，P ＜0.001，说明随着临床分期的增高，SCCA2 mRNA的表达增高。而SCCA1 mRNA在不同临床分期之间差异无统计学意义(F=2.734，P=0.083)。

表3 SCCA mRNA表达与年龄、淋巴转移、病理分级、临床分期的关系Tab 3 Correlation of expression of SCCA mRNA with age，lymph node metastases，histological grade and FIGO stages

3 讨论

鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)作为鳞癌相关抗原，血清学检测已广泛被用于临床子宫颈鳞癌辅助诊断，鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的一个成员，存在于子宫颈、子宫、头颈等鳞状上皮细胞的细胞质中，特别是在非角化大细胞中含量丰富。但单独测定SCC-Ag不能作为子宫颈鳞癌的诊断依据。Bugru等［3］发现检测癌症患者外周血中SCCA mRNA可以改善常规检查的较低诊断率。SCCA就其生物学活性来说属丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，目前产生SCCA的两种形式的基因SCCA1和SCCA2已被鉴别，其定位在常染色体 18q21.3 中大约 500 kb 的区域［4，5］，SCCA1和SCCA2在核苷酸水平上有98%的同源性，在氨基酸水平上有92%的同源性［6］，两种基因分别编码SCCA的两种形式，SCCA1编码中性形成的蛋白，SCCA2编码酸性形成的蛋白。Barnes等［7］研究发现，SCCA2在宫颈鳞癌中的表达明显增高，他认为此基因是更重要的肿瘤标记物。

在组织中检测mRNA水平的SCCA1和2是困难的，因为两者在核苷酸水平上有高度的同源性，Takeda等［8］发现用 RT-PCR可以区别组织中 SCCA1和SCCA2 mRNA的表达，同时Zen等［9］测定口腔鳞癌患者外周血中的SCCA mRNA和表皮生长因子mRNA，使用一般RT-PCR只能在少数病例中测到，而使用TaqMan RT-PCR时大约50%病例中有表达。本研究采用TaqMan探针实时荧光定量法分析60例子宫颈鳞癌组织及30例正常子宫颈组织中SCCA1和SCCA2 mRNA的表达，结果表明，SCCA2 mRNA在宫颈鳞癌组织表达明显高于正常宫颈组织，而SCCA1 mRNA在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)，Murakami等［10］研究发现 SCCA2 mRNA 的拷贝数在恶性组织中比正常组织中高，而SCCA1则没有明显的不同。这与本试验的研究结果相符。并且Murakami等还认为有效地定量SCCA2 mRNA在鳞癌患者诊断和治疗过程中是非常有意义的。因为SCCA2调节细胞迁移和侵袭病毒感染相关抗原E钙蛋白的表达，而E钙黏蛋白是一个与子宫颈鳞癌浸润转移有关的预后因素［11］，因此他们认为SCCA2可能与癌的侵袭和转移行为有关。Nawata等［12］认为过度表达的SCCA2基因可能在肿瘤细胞的共性行为中扮演重要角色。

SCCA2 mRNA的表达与淋巴转移的关系:肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤发展的两个关键步骤，也是影响预后的重要因素，肿瘤的转移是个高选择、多步骤、多因素参与肿瘤细胞和宿主细胞相互作用的连续过程。子宫颈癌以直接侵犯邻近组织和淋巴结转移为主，血行转移极少，影响子宫颈癌预后的临床病理因素很多，其中淋巴结转移是显著的独立预后因素。文献报道，无淋巴结转移患者5年生存率为82.2%，有淋巴结转移者 5年生存率则为50.8%［13］。本实验研究发现有淋巴结转移组 SCCA2 mRNA的表达较无淋巴结转移组高(t=2.853，P＜0.01)，SCCA1 mRNA表达则无此特点。由于肿瘤的浸润和转移都需要细胞外基质和基底膜的降解，推断SCCA2能够改变鳞癌细胞的侵袭表型，可能是通过刺激MMP-9蛋白的产生，而明胶酶MMP-9能分解基质膜中的巢蛋白，在肿瘤的侵袭转移中起重要作用。另外，试管内侵袭分析发现SCCA1和SCCA2能显著助长细胞的侵袭能力。本实验仅发现SCCA2有此特点，因此还需大样本实验进一步证实。

SCCA2 mRNA的表达与临床分期的关系:近年来临床上提出了“肿瘤分子分期”的观点，即将分子生物学的理论和技术与肿瘤的临床分期有机地结合起来，来诊断那些常规检查方法不能诊断的存在于全身各系统中的亚临床转移，使肿瘤的分期更加准确，以指导临床治疗方案的确定。本实验结果显示随临床分期的增高，子宫颈鳞癌组织中SCCA2 mRNA的表达有增高趋势(r= －0.616，P ＜0.001)，SCCA2 mRNA的检测有助于准确分期，从而更加有针对性制定个性化的治疗方案，为改善预后提供可能。

SCCA1和SCCA2 mRNA在鳞状上皮层呈特异性地表达，应用TaqMan探针real-time-PCR方法可以定量检测mRNA的水平，能够较直观反映宫颈癌组织中SCCA的表达水平，为SCCA在宫颈癌的早期诊断、临床分期及预后提供一定的理论依据，但关于SCCA1和SCCA2在肿瘤的发生发展过程中的各自及相互作用机制还需要深入研究。

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