何 敏,卢思广

(1.徐州医学院,江苏徐州 221002;2.徐州医学院附属连云港第一人民医院儿科,江苏连云港 222000)

30多年前,研究者发现了大量具有解除特异抗原的免疫应答的淋巴细胞。在1975年,这些细胞被命名为抑制细胞,即目前的 T reg细胞,它可抑制器官移植的排斥反应[1]。Treg细胞表面高表达CD25,而胞内Foxp3基因是其一个相对特异标志和功能分子,高表达Foxp3基因的Treg细胞对于维持免疫系统的内环境的稳定和预防自身免疫疾病有极其重要的作用[2]。而Foxp3基因的稳定表达可通过表观修饰方式调节,如组蛋白及DNA修饰。在Treg细胞中,foxp3启动子区的CPG模体几乎完全去甲基化,显示稳定的Foxp3的表达,而CD4+CD25-T细胞正好相反[3,4]。目前,5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2dc)是研究最多的去甲基化药物,它能够逆转基因的甲基化状态,从而恢复基因的表达水平。近年来,国内外对组蛋白去乙酰化抑制酶试剂(如TSA)通过表观修饰研究较多,但使用DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-2dc诱导Treg细胞研究较少,特别是这种药物对Treg细胞表型维持的研究。本研究中,用5-Aza-2dc试剂使DNA去甲基化,促进特异基因Foxp3的表达,并可使CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞,从而为稳定与预防自身免疫疾病提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 材料

PHA(美国Sigma);人Treg分选试剂盒和MACS分选器(德国Miltenyi);MTT试剂(美国Sigma);5-Aza-2d(美国Sigma);人淋巴细胞分离液(加拿大Cedarlane);酶标仪(美国BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1 PHA最佳浓度的摸索

用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液调整PBMC密度至 1×106/mL,并加入不同终浓度PHA(0μ g/mL、μ g/mL、7.5μ g/mL 、10μ g/mL 、12.5μ g/mL),每个浓度设置 5个复孔,置37℃、5%CO2条件下培养 68h,然后加入 MT T继续培养 0h、2h、4h、6h,在倒置显微镜下观察细胞的显色,分别上酶标仪波长450nm,参考波长650nm,检测各孔细胞光密度值(OD值),确定最佳的检测时间和刺激浓度。……