魏世安

(重庆市涪陵区龙桥街道畜牧兽医站，重庆涪陵 408121)

猪呼吸道综合征(PRDC)已成为影响养猪业的重要群发性疾病之一。猪多杀性巴氏杆菌是猪呼吸道综合征(PRDC)的重要原发感染菌或继发原菌。因此，其诊断技术越来越受到世界各国的重视。对多杀性巴氏杆菌的诊断技术的重要性突显出来。现将猪多杀性巴氏杆菌的诊断综述如下。

一、临床诊断

多杀性巴氏杆菌是引起多种畜禽巴氏杆菌病的病原体，主要使动物发生出血性败血病或传染性肺炎。此菌广泛分布与世界各地， PRDC的病原可分为原发和继发病原两类，正常存在与多种健康动物的口腔和咽部黏膜，当动物处于应激状态，机体抵抗力低下时，细菌侵入体内，大量繁殖并致病，发生内源性传染。

（一）流行病学特征根据流行病学特征多杀性巴氏杆菌病一年四季均可发病，多在春夏呈暴发,且在同种或不同种动物间可互相传染，蜱和蚤被认为是自然传播的媒介昆虫。

临床症状表现为病猪突然发病，死亡率高。多数体温升高到41.5℃～42.0℃，食欲减退或废绝，全身衰弱、卧地不起，烦躁不安，咳嗽气喘，呼吸困难，心跳加快，颈下咽喉部发热、红肿、坚硬，严重者向上蔓延及耳根，向后达及胸前，粪便干燥或腹泻，呈暗绿色，并带有恶臭等为特征疾病。发病后，迅速死亡，也可能拖延3～5 d。视具体情况而定。

（二）病理剖检病猪剖检，可以发现皮下组织可见出血点，主要病变以咽喉部及其周围结缔组织、淋巴结的浆液性出血炎症和喉头气管内充满淡黄色胶胨样分泌物为特征。可见到大量的胶胨样淡黄色纤维素浆液。水肿自颈部延至前肢；全身淋巴结有轻度的肿胀、出血、切面深红；心包膜有小出血点；肺水肿，呈红白相间的大理石花纹，肺胸膜表面可见到红褐色到灰红色斑点状病变区，胸腔积液，大多数病变在膈叶，有小指头到鸡蛋大小的局部性化脓灶、出血灶，严重者胸膜常有纤维素性附着物，肺泡腔、细支气管、支气管腔内有嗜中性粒细胞浸润，伴有黏膜上皮纤维素性变化、脱落，肺呈大叶性肺炎，间质水肿出血，粘连性纤维素性胸膜炎； 脾有出血。

（三）诊断技术

1.实验室微生物学诊断技术。实验室微生物学诊断可分为以下三部分。

（1）显微镜检查。取病猪的渗出液、心血、肝、脾、淋巴结、骨髓等新鲜组织涂片或触片，以瑞氏染色液或碱性美兰液染色时，镜检可见典型的两极着色的短杆菌，即菌体两端染色深，中间浅，无鞭毛，不形成芽孢，有荚膜，即可初步诊断。纯培养物进行革兰氏染色、镜检，可见两端钝圆的革兰氏阴性球杆状或短杆状菌。

（2）细菌分离、培养与鉴定。分离培养可用病猪肺组织、肝脏、心血等新鲜病料，接种鲜血琼脂平板、马丁氏血清琼脂平板、麦康凯琼脂平板和血清肉汤培养基，马丁氏血清琼脂平板上菌落呈圆形、微隆起、灰白色露滴状，中等大小。在血琼脂平板上长成水滴样小菌落，无溶血现象。在血清肉汤中培养，开始轻度浑浊，4～6 h后液体变清亮，管底出现粘稠沉淀，震摇后不分散，表面形成菌环。在麦康凯琼脂上不生长。巴氏杆菌可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和半乳糖，产酸不产气，不分解乳糖、鼠李糖、杨苷、肌醇和菊糖，产生H2S, 能形成靛基质，触酶和氧化酶均为阳性，M.R.和V-P试验均为阴性，石蕊牛乳无变化，不液化明胶。

（3）动物实验。可用病料制成1:10悬液，或用已制成的分离培养菌，皮下注射小鼠、家兔或鸽，动物多在24～48 h内死亡。由于健康动物呼吸道内常可带菌，所以应参照病畜的生前临床症状和剖检变化，分离培养、生化特性作出最后诊断。

若要鉴定荚膜抗原和菌体抗原型，则要用抗血清或单克隆抗体进行血清学实验。检测动物血清中的抗体，可用试管凝集、间接凝集、琼脂扩散实验或ELISA等方法。

2.PCR诊断技术。聚合酶链式反应(PCR)作为一种分子生物学实验技术，具有快速、敏感性高、特异性强、重复性好、易于标化和操作等优点，对检测标本中病原体的核苷酸特异片段具有常规诊断方法不具备的一些优点，且应用于细菌、病毒的诊断及检测已有较多的报道，因此用PCR技术检测多杀性巴氏杆菌对多杀性巴氏杆菌病的诊断鉴定可取得准确的结果。

在PCR的诊断及检测中DNA模板的质量是影响PCR检测灵敏度的个重要因素。其中细菌DNA提取可用猪多杀性巴氏杆菌菌落，用常规SDS裂解法和常规煮沸裂解法(DNA快速抽提法)提取DNA作为PCR反应的DNA模板，且实践证明虽然两种方法敏感度相当，但DNA快速抽取法更简便、节时。同一浓度的多杀性巴氏杆菌分别用这两种方法DNA，并通过蛋白核酸测定仪测定DNA浓度，两者差异不大。但由于SDS会抑制Taq酶活性，必须用酚-氯仿反复抽提，操作繁琐，常导致猪多杀性巴氏杆菌DNA提取纯度受到影响，而使本PCR方法不稳定。与常规煮沸裂解法比较，在猪多杀性巴氏杆菌的DNA模板处理过程，配以应用快速延伸Taq酶，可缩短PCR操作时间。

二、总结

目前对猪多杀性巴氏杆菌病的诊断常采用实验室微生物学诊断，即病变组织的涂片染色镜检和病原分离，纯化、生化鉴定等方法，但这些方法较繁杂、费时。聚合酶链式反应(PCR)作为一种分子生物学实验技术，具有快速、敏感性高、特异性强、重复性好、易于标化和操作等优点，对检测标本中病原体的核苷酸特异片段具有常规诊断方法不具备的一些优点，且应用于细菌、病毒的诊断及检测，在对猪多杀性巴氏杆菌病以及很多疾病的诊断上已有较多的报道，展示了PCR方法良好的应用前景。

（略）