史亚军，施俊辉，刘剑云，唐梅，黄勤挽，杨明

·论著·

贝加灵喷雾剂对大鼠全脑缺血的保护作用

史亚军，施俊辉，刘剑云，唐梅，黄勤挽，杨明

目的研究贝加灵喷雾剂对大鼠全脑缺血的保护作用，并初步探讨其作用机制。

脑缺血； 自由基清除剂； 脑代谢改善药；黄苓甙； 动物实验

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(6):450-454

脑缺血损伤指由于脑动脉管腔狭窄或堵塞，局部脑血流量减少或突然中断，造成该动脉供应区的脑组织供血、供氧、供能减少，继而引起继发性的血管内皮损伤和自主神经功能障碍的一种病理状态[1]。缺血性脑损伤疾病以其高发病率、高致残率和高死亡率而严重危害着人们的身心健康。

近年来有学者研究发现，以黄芩苷为主要成分的黄芩提取物可从抑制兴奋性氨基酸毒性作用、抗自由基毒性损伤、干预细胞内钙超载、抑制凋亡调控基因的激活、抑制炎症因子的表达，以及保护线粒体功能等方面对中风引起的缺血性脑损伤具有积极的修复治疗作用[2]，这无疑对进一步深化对黄芩既往功效的认识，探索利用其新的药理作用具有积极的意义，同时也对研究开发治疗缺血性脑损伤疾病的药物给予了积极的推动作用。

贝加灵喷雾剂是以黄芩提取物磷脂复合物为原料制备而成的亚微乳经鼻给药制剂。黄芩提取物因其脂溶性、水溶性差等原因造成体内吸收差、生物利用度低，极大影响其药效的发挥。根据前期研究结果[3]，将其制备成磷脂复合物，再制备成亚微乳，提高其溶解度与稳定性，增加组织亲和力，使其充分发挥药效。本实验通过双侧颈总动脉结扎复制全脑缺血模型，测定贝加灵喷雾剂对全脑缺血大鼠的脑指数，观察脑组织病理形态学改变，测定大鼠缺血脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和 ATP 酶的含量，研究制剂对全脑缺血模型大鼠脑组织的保护修复作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 健康 SD 大鼠 168 只，体重（250 ± 25）g，雌雄各半，购于成都达硕生物科技有限公司，合格证号：SCXK（川）2010-24，饲养于清洁级动物房。

1.1.2试剂与仪器 贝加灵喷雾剂和空白乳剂为成都中医药大学药学院中药药剂教研室自制；阳性对照品尼莫地平购自山东东方药业股份有限公司（批号：1005191）；水合氯醛购自成都市科龙化工试剂厂（批号：20100920）；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号：20101224）、SOD 试剂盒（批号：20101015）、MDA 试剂盒（批号：20101227）、超微量 ATP 酶（总）测试盒（批号：20101119）均购自南京建成生物工程研究所；UV-1700 型紫外可见分光光度计为日本岛津公司产品；BS-200s-WEI型电子天平为北京赛多利斯公司产品；FLUKO F6/10-10G 型超细匀浆机为弗鲁克（上海）流体机械制造有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1动物分组 大鼠适应饲养 1 周，随机分为A（手术后给药 7 d）、B（手术后给药 15 d）两大组，每大组再随机分为 7 小组，即假手术组、模型组（对照组）、贝加灵高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组（尼莫地平组）、空白乳剂组，每组 12 只。

1.2.2给药方案 A 组在模型制作完成后给药7 d，B 组在模型完成后给药 15 d，各组均每日给药 2 次。给药剂量：①阳性对照组：尼莫地平以1.00 mg/kg 的剂量注射给药；②贝加灵高剂量组：以 10.68 mg/kg 的剂量滴鼻给药；③中剂量组：以 5.32 mg/kg 的剂量滴鼻给药；④低剂量组：以2.68 mg/kg 的剂量滴鼻给药；⑤空白乳剂组：按贝加灵中剂量滴鼻给予空白乳剂；⑥假手术组和模型组：通过滴鼻给予中剂量组相同体积的生理盐水。

1.2.3双侧颈动脉阻断法大鼠全脑缺血模型制作 大鼠用 10％ 水合氯醛（35 mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定，碘伏擦拭消毒，腹侧颈正中线切开皮肤，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离到气管前肌后，沿右侧胸锁乳突肌腱向下分离，见到颈动脉鞘后可上拉钩，分离双侧颈总动脉（CCA），用细线分别结扎两侧 CCA，常规缝合；假手术组只进行麻醉和血管分离术，不结扎血管。手术后 A、B 两组大鼠分别给药 7 d 和 15 d。

1.2.4脑指数的测定 实验完成后，处死大鼠，称取全脑重量（g），计算脑指数，脑指数 = 全脑重量（g）/体重（g）。

1.2.5脑组织切片的制备 大鼠全脑左右半球分开，取右脑放于装有中性福尔马林的小瓶内作为病理切片用。脑组织以甲醛饱和液和 pH 7.4 的 PBS缓冲液配制的 10％ 中性甲醛固定液（体积比为1∶9）浸泡 8 h，沥干固定液，依次用 70％、80％、90％、95％ 和无水乙醇浸泡脱水，沥干，再用二甲苯浸泡 0.5 h，沥干，浸蜡、包埋，然后切片、摊片、烤片，最后 HE 染色、封片、归档。对大鼠脑组织进行病理学损伤评价，根据形态学表现按照表 1 评分标准进行评价。

1.2.6大鼠脑组织匀浆液的制备 取左侧脑组织，加 9 倍量生理盐水于冰浴中用超细匀浆器匀浆 1 min，以 1300 ×g离心 10 min，取上清液，置超低温冰箱保存备用。

表1 大鼠病理损伤程度评分标准Table 1 The score standard for the degree of rat brain tissues

1.2.7生化指标的测定 取大鼠脑组织均浆液，参照南京建成生物工程研究所提供的考马斯亮兰蛋白浓度、ATP 酶、SOD、MDA 检测试剂盒的操作说明测定。

1.3 统计学处理

采用 SPSS17.0 统计软件对每组各指标进行统计学分析。统计采用单因素方差分析和t检验，以P＜ 0.05 为统计结果有显著性差异。

2 结果

2.1 对大鼠脑指数的影响

手术后给药 7 d，与假手术组比较，模型组脑指数显著增高，表明模型组脑组织水肿明显；与模型组相比，贝加灵高、中、低剂量组、阳性对照组的脑指数显著降低。术后给药 15 d 的情况与术后给药 7 d 的类似，但降低脑指数的效果更明显。实验前后，与模型组相比，贝加灵高、中、低剂量组，阳性对照组的体重显著增加（表 2）。

表2 大鼠脑指数及体重变化水平（±s，n = 6）Table 2 The level of brain index and weight change of rats (±s, n = 6)

表2 大鼠脑指数及体重变化水平（±s，n = 6）Table 2 The level of brain index and weight change of rats (±s, n = 6)

注：与模型组相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；与治疗 7 d 比较，cP＜ 0.05。Notes: Compared with the model group, aP＜ 0.05, bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group, cP ＜0.05.

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图1 大鼠脑组织病理学观察（A：7 d 模型组；B：7 d 空白乳剂组；C：7 d 阳性对照组；D：7 d 高剂量组；E：7 d 中剂量组；F：7 d 低剂量组；G：15 d 模型组；H：15 d 空白乳剂组；I：15 d 阳性对照组；J：15 d 高剂量组；K：15 d 中剂量组；L：15 d 低剂量组；M：假手术组）Figure 1 Histopathological obserevation of rat brian tissues (A: 7 d model group; B: 7 d blank emulsion group; C: 7 d positive control group; D: 7 d high dose group; E: 7 d middle dose group; F: 7 d low dose group; G: 15 d model group; H: 15 d blank emulsion group; I: 15 d positive control group; J: 15 d high dose group; K: 15 d middle dose group; L: 15 d low dose group; M: Sham operation group)

2.2 对大鼠脑组织病理形态的影响

大鼠全脑缺血后给药 7 d 的脑组织病理学切片见图1A ～ F，可见模型组和空白乳剂组有较多胶质细胞增生，水肿较严重，而贝加灵高、中、低剂量组和阳性组有轻度水肿；G ～ L 是大鼠全脑缺血后给药 15 d 的脑组织病理学切片，其情况与术后7 d 类似，但是组织损伤程度评分略有降低，损伤程度评分见表 3。

2.3 大鼠脑组织 SOD 水平

手术后 7 d和 15 d，与假手术组比较，模型组SOD 活力显著降低；与模型组相比，贝加灵高、中、低剂量组、阳性组的 SOD 含量显著升高。空白乳剂组的 SOD 活力高于模型组，但无显著性差异（P> 0.05）。手术后 7 d SOD 含量与手术后 15 d无显著性差异（P> 0.05），但是总体有升高趋势（表 4）。

表3 各组大鼠脑组织病理损伤程度（±s，n = 6）Table 3 The degree of pathological injury of rat brain tissues (±s, n = 6)

表3 各组大鼠脑组织病理损伤程度（±s，n = 6）Table 3 The degree of pathological injury of rat brain tissues (±s, n = 6)

注：与模型组相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；与治疗 7 d 比较，dP> 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05,bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,dP> 0.05.

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2.4 大鼠脑组织 MDA 水平

手术后 7 d和 15 d，与假手术组比较，模型组MDA 含量极显著升高；与模型组相比，贝加灵高、中、低剂量组和阳性组的 MDA 水平极显著性降低。空白乳剂组 MDA 含量低于模型组，但是无显著性差异（P> 0.05），与手术后 7 d 相比，手术后15 d MDA 含量显著升高（表 5）。

表4 大鼠脑组织 SOD 水平（±s，n = 6）Table 4 The level of SOD of rats (±s, n = 6)

表4 大鼠脑组织 SOD 水平（±s，n = 6）Table 4 The level of SOD of rats (±s, n = 6)

注：与模型组相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；与治疗 7 d 比较，dP> 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05;bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,dP> 0.05.

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表5 大鼠脑组织 MDA 水平（±s，n = 6）Table 5 The MDA level of rat brain tissues (±s, n = 6)

表5 大鼠脑组织 MDA 水平（±s，n = 6）Table 5 The MDA level of rat brain tissues (±s, n = 6)

注：与模型组相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；与治疗 7 d 比较，cP＜ 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05,bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,cP＜ 0.05.

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2.5 大鼠脑组织 ATP 酶水平

手术后 7 d 和 15 d，与假手术组比较，模型组 ATP 酶含量极显著降低；与模型组相比，贝加灵高、中、低剂量组和阳性组 ATP 酶含量极显著升高。空白乳剂组 ATP 酶含量低于或高于模型组，但是无显著性差异（P> 0.05）。与手术后 7 d 相比，手术后 15 d ATP 酶含量显著降低（表 6）。

表6 大鼠脑组织 ATP 酶水平（±s，n = 6）Table 6 The ATPase level of rat brain tissues (±s, n = 6)

表6 大鼠脑组织 ATP 酶水平（±s，n = 6）Table 6 The ATPase level of rat brain tissues (±s, n = 6)

注：与模型组相比，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01；与治疗 7 d 比较，cP＜ 0.05。Notes: Compared with the model group,aP＜ 0.05,bP＜ 0.01; Compared with the 7 d group,cP＜ 0.05.

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3 讨论

人们对脑缺血的发病机制认识经历了一个漫长的过程，最初仅停留在脑血流量减少、缺血缺氧、能量代谢障碍的表象认识，随后逐渐深入到细胞分子方面，其发病机制涉及脑组织能量代谢缓慢、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、钙超载、神经细胞凋亡等多个环节[4]，是一个复杂的病理过程。

氧自由基可以与生物大分子尤其是生物膜上的不饱和脂肪酸反应，形成脂质过氧化物（如MDA），破坏膜细胞。由于脑组织中缺乏 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶，且富含脂质，对氧自由基的损伤尤为敏感，因此自由基在缺血再灌注损伤中起着非常重要的作用。清除自由基、切断自由基对脑缺血的继发性损害是防治急性缺血性脑卒中的重要途径之一。ATP 酶是存在于组织细胞生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换及信息传递方面具有重要作用，脑缺血缺氧时，ATP 酶活力明显下降，导致脑细胞代谢异常，细胞膜钠泵发生功能障碍，细胞内钠水潴留，从而出现脑细胞水肿，表现为脑指数和脑含水量增加[5]，同时又可促使脑组织 SOD 活性下降，超氧阴离子大量产生，从而加剧脑细胞损伤[6]。

本实验结果显示，贝加灵喷雾剂能明显对抗大鼠脑缺血导致的脑组织病理损伤，可显著降低全脑缺血大鼠的脑指数，明显改善脑缺血引起的脑神经细胞病变，降低缺血性脑组织的含水量；可显著提高缺血性脑组织中 SOD 活力，抑制 MDA 生成，表明其可通过抗自由基作用对缺血脑细胞起到保护作用；显著增强缺血性脑组织中 ATP 酶活力，提示其可能通过改善缺血脑细胞能量代谢对受损脑细胞起到修复作用；治疗 15 d MDA 与 ATP 酶含量较治疗 7 d 都相应地显著升高与降低，治疗15 d SOD 含量较治疗 7 d 有升高的趋势，治疗15 d 各组脑指数显著低于治疗 7 d，说明改善水肿与给药时间存在一定的时效关系。

从实验结果可以看出，贝加灵喷雾剂能对抗缺血而导致的大鼠脑组织病理损伤，增强大鼠机体内抗自由基能力，改善脑组织能量代谢，对大鼠全脑缺血性脑损伤有一定修复保护作用。这也为贝加灵喷雾剂治疗缺血性脑损伤疾病提供一定的实验依据，为药物的进一步研究奠定了基础。但从实验结果可以看出，尚无明显量效关系，可能和鼻腔给药剂量的准确性有一定关系，后续将对如何定量准确地给药作进一步的研究，以期获得相关数据。

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Protective effect of baicalin spray on complete cerebral ischemia in rats

SHI Ya-jun, SHI Jun-hui, LIU Jian-yun, TANG Mei, HUANG Qin-wan, YANG Ming

ObjectiveTo study the protective effect of baicalin spray on complete cerebral ischemia in rats, and to explore its possible therapeutic mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into groups A (7 days after operation) and B (15 days after operation). Each group was divided into seven sub-groups that included sham operation group, model group, high dose, middle dose and low dose of baicalin’s spray group, positive control group and blank emulsion group, with 12 rats in each sub-group. Complete cerebral ischemia rat model was established by two artery blocking method, and brain tissue pathomorphology as well as brain index was observed and calculated respectively. Moreover, the content of SOD, MDA and ATPase in brain tissues were measured by spectrophotometric analysis.ResultsBrain indexes of the high, middle and low dose of baicalin’s spray group were all lower than that of the model group (P ＜ 0.05 for 7 d, P ＜ 0.01 for 15 d). Furthermore, brain tissue pathomorphology was markedly improved, the content of SOD and ATPase were increased, while the content of MDA was significantly deceased in drug-treated group, when compared with the model group (P ＜ 0.01). Compared with treatment group for seven days, brain indexes and the content of ATPase in treatment group for 15 days were remarkably decreased (P ＜ 0.05), and the content of MDA was remarkably increased (P ＜ 0.05), with no significant difference found for SOD level.ConclusionBaicalin spray has protective effect on complete cerebral ischemia injury, possibly due to its free radical scavenging ability as well as and theimprovement of energy metabolism.

Brain ischemia; Free radical scavengers; Nootropic agents; BAICALIN; Animal experimentation

YANG Ming, Email: yangming16@126.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.012

国家“重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09103-353）

611137 成都中医药大学药学院（史亚军、施俊辉、刘剑云、唐梅、黄勤挽、杨明）；712046 咸阳，陕西中医学院药学院（史亚军）；330004 南昌，江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室（杨明）

杨明，Email：yangming16@126.com

2011-10-19

方法SD 大鼠随机分为两大组，即 A 组（给药 7 d）与 B组（给药 15 d），每大组分为 7 小组，即假手术组、模型组、贝加灵高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组和空白乳剂组，每组 12 只。采用双侧动脉阻断法建立大鼠全脑缺血模型，观察大鼠脑组织病理形态学改变，测定大鼠脑指数，并利用分光光度法测定大鼠缺血脑组织均浆液中超氧化物歧化酶、丙二醛和 ATP 酶的含量。

结果与模型组相比，贝加灵高、中、低剂量组脑指数显著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01）；给药组脑组织病理形态显著改善；脑组织 SOD 活力、ATP 酶含量显著升高（P＜ 0.01），MDA 含量显著降低（P＜ 0.01）；与治疗 7 d 比较，治疗15 d 的脑指数与 ATP 酶含量显著降低（P＜ 0.05），MDA含量显著升高（P＜ 0.05），SOD 水平则无明显差异。

结论贝加灵喷雾剂对大鼠全脑缺血有一定修复保护作用，可能是通过抗自由基和改善能量代谢来发挥这一作用。

Author Affiliations:College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China (SHI Ya-jun, SHI Jun-hui, LIU Jian-yun, TANG Mei, HUANG Qin-wan, YANG Ming); College of Pharmacy, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China (SHI Ya-jun); Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Ministry of Education, Nanchang 330004, China (YANG Ming)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(6):450-454