刘娟，姜涛，秦鄂德，秦成峰

·生物诊断技术·

环介导等温扩增技术在流感病毒检测中的应用

刘娟，姜涛，秦鄂德，秦成峰

流感病毒是引起人类流感的病原体之一，属于正黏病毒科，分为甲型、乙型和丙型流感病毒，其中甲型和乙型流感病毒对人类具有流行病学意义。流感病毒感染可导致一系列呼吸道疾病，临床症状从轻微的上呼吸道症状至急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭，甚至死亡[1]。流感大流行传播迅速，波及范围广，发病率和死亡率高，严重威胁着人类健康。1918 年的 H1N1“西班牙流感”、1957 年 H2N2“亚洲流感”和 1968 年 H3N2“香港流感”三次流感大流行导致全球超过 5000 万人死亡。最近暴发的 2009 年新甲型H1N1 流感大流行，全球估计有数亿人感染，约 2 万确诊死亡病例[2]。因此流感病毒的早期快速检测技术对于流感的防控及治疗具有重要的意义。

2000 年，Notomi 等[3]建立了一种新型的快速核酸扩增方法——环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。近些年 LAMP 方法逐渐受到关注，其在病毒性疾病诊断中得到了广泛的应用[4]。本文特针对该技术在流感病毒检测中的应用和前景作一综述。

1 流感病毒的检测方法

流感病毒的早期快速检测对流感的防控非常重要，不仅可缩小呼吸道疾病的传播范围及风险，同时也为临床呼吸道疾病病原诊断及用药提供可靠的依据。目前流感病毒的检测技术主要包括病毒分离、血清学检测、病毒抗原检测和核酸检测。临床早期诊断较为常用的快速检测方法主要包括免疫层析法和病毒核酸检测技术[5]。免疫层析法是近年来发展的一种快速诊断技术。该技术利用免疫胶体金或免疫酶染色可使特定区域显示一定的颜色，从而实现特异性的快速免疫诊断。这类方法目前存在的主要问题是灵敏度较低[6]。目前流感病毒早期快速检测最主要的手段仍然是核酸检测方法，主要包括逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光RT-PCR 技术，但常规 PCR 技术需要电泳判读结果，易造成环境污染；实时技术则需要较昂贵的仪器，这些限制了该项技术在流感病毒检测中的广泛应用。

2 LAMP 技术的原理

LAMP 法是一种新型的核酸扩增技术，与传统的核酸检测方法相比，具有灵敏性及特异性高、简便快速易于判断等多种优点。LAMP 反应是在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作用下，利用能识别目的基因上 6 个独立区段的4 条引物（图1），即正向内侧引物（orward inner primer， FIP）、正向外侧引物（forward outer primer，F3）、反向内侧引物（backward inner primer，BIP）、反向外侧引物（backward inner primer，B3），在 60 ～ 65 ℃ 恒温条件下高效特异地扩增目的基因，普通恒温装置例如水浴锅中即可完成，不需要特殊的仪器，60 min 内即可完成实验。反应中亦可添加靶向 F1 与 F2 或 B1 与 B2 区域间的 1 ～ 2 条环引物（loop primer），以提高扩增反应速度。

反应终产物是同一条链互补序列周而复始形成的大小不一哑铃状 DNA，LAMP 法在高效扩增过程中，一般至少可生成 10 μg/25 μl 产物，同时产生大量焦磷酸根离子，其与金属离子形成不可溶的盐，生成肉眼可见的白色焦磷酸盐沉淀，因此可直观观察扩增结果[7]。在反应体系中加入荧光染色试剂，可在紫外光或直接在日光下观察颜色变化，无需电泳或特殊仪器。

图1 LAMP 引物设计示意图[5]

3 LAMP 在流感病毒检测中的应用

流感检测方法的临床意义主要取决于其快速性。LAMP方法是一种快速简便易行的检测方法。近些年来已建立了多种针对季节性流感病毒、禽流感病毒和猪流感病毒 LAMP快速检测方法（表 1）。这些方法多以 HA 或 M 基因作为靶基因，HA 是流感病毒重要的表面抗原蛋白，是分型的重要依据，因此多用于设计区分不同亚型的 LAMP 方法。M蛋白相对保守，主要用于设计同时检测多种亚型流感病毒的通用 LAMP 法。

Ito 等[8]针对季节性流感病毒 H1 和 H3 亚型的 HA基因以及乙型流感病毒 NP 基因，建立了区分人季节性甲型 H1、H3 亚型和乙型流感的 LAMP 检测方法。该方法检测 H3 亚型流感病毒的灵敏性高达 10 FFU/ml（约为1.5 FFU/反应），且仅需 1 h 反应时间；特异性良好，采用不同时间不同地点分离的不同亚型流感病毒进行评估，均未观察到交叉扩增现象。临床样本进行验证过程中 RT-LAMP法优于商业免疫层析试剂盒。随后，Poon 等[9]建立了基于流感病毒基质蛋白 M 基因的 LAMP 方法，可同时检测季节性 H1、H2 和 H3 亚型，灵敏性高达 0.001 PFU/反应，特异性也非常理想。临床标本评估的结果显示该方法与乙型流感病毒以及其他临床呼吸道传染病的常见病原体例均无交叉反应。

禽流感病毒属于一种人畜共患的流感病毒，有报道指出在北美和欧洲 15％ 的鸭及超过 2.8％ 野鸟中均可分离到禽流感病毒[10]。近些年来，东南亚等地屡次出现高致病性禽流感人感染病例的报道，提示应引起足够的重视。Jayawardena 等[11]建立的高致病性禽流感 H5N1 特异LAMP 技术，对近十年间人和禽的 H5N1 流感病毒均有理想的检测效果，其灵敏度高达 0.002 PFU/反应。另一研究所建立的 H5N1 特异 LAMP 方法也具有非常理想的灵敏度，是普通 RT-PCR 的 100 ～ 1000 倍[12]。此外，特异检测禽流感病毒 H9 亚型的 LAMP 法也相应建立，灵敏性也高达 10 拷贝/反应，较普通 RT-PCR 方法高 10 倍；采用 112份鸭禽病例进行评估，RT-LAMP 法得到的结果与病毒分离完全一致[13]。H3 亚型禽流感病毒也是重要的一类禽流感，有通过基因重组直接感染人类的巨大风险[14-15]。Peng 等[16]建立的针对 H3 亚型禽流感病毒 HA 基因的 RT-LAMP法可检测到最低 1 pg/反应的病毒 RNA，且结果可通过颜色变化进行野外样本的检测。我国初亚男等[17]针对禽流感病毒 M 基因上保守序列设计禽流感病毒通用的 LAMP检测方法，灵敏度可达 10 拷贝/反应，并可进一步通过扩增禽流感病毒（H5N1、H7N7 和 H9N2）3 种亚型特异 HA基因进一步鉴定病毒亚型。

猪是流感自然循环中重要的环节，人和禽流感均可感染猪，猪流感病毒亦被证实可感染人类[18]，因此三种流感病毒在猪体内发生病毒重配/重组的风险很大。2009 年流行的新型 H1N1 流感病毒与猪流感病毒也密切相关。目前已建立了针对 H3 亚型猪流感病毒的 LAMP 检测方法，检测灵敏度为 1 PFU/反应，是普通 RT-PCR 法灵敏度的 10 倍[19]。2009 年甲型 H1N1 流感大流行暴发后，相应的 LAMP 检测方法也迅速建立，检测灵敏度为 10 ～ 20 拷贝/反应，与实时 RT-PCR 灵敏度相同[20-21]。

表1 流感病毒 LAMP 检测方法

4 RT-LAMP 法的优势与不足

简便快速的 RT-LAMP 方法为缺少仪器和条件的基层医疗和检疫单位的流感防疫提供重要手段。已有针对禽流感病毒 H5、H7 亚型的商业化 RT-LAMP 检测试剂盒在流感病毒的检测方面得到了初步应用。与目前临床和实验室检测所应用的检测方法相比，RT-LAMP 法具有一些特有的优势：如不需要昂贵的设备，适合现场和野外使用；判读也仅需通过肉眼在日光下即可直观地判断结果，当在扩增管内加入染色剂（如 SYBR Green I[22]、钙黄绿素[6]和羟基萘酚蓝[20]等）时，阳性扩增管相对阴性会发生颜色变化（日光下）和呈现荧光（紫外光下），更易于判读。这些优势使得RT-LAMP 法可快速便捷地应用于各种环境中，尤其适用于基层卫生医疗机构。在灵敏度上，RT-LAMP 的灵敏度一般也与实时 RT-PCR 法相当，高于普通 RT-PCR 法灵敏度10 ～ 100 倍，可满足临床检测的需要。

LAMP 法也存在一些不足。例如，该技术的引物设计要求同时识别 6 个部位的 4 种引物，在实际应用中引物设计较为困难，特别是针对不同亚型流感病毒以及病毒科属的通用引物；另一方面，也易导致其灵敏度在检测不同病毒株时存在较大差异，因此其应用还需进一步的评估和改进[23]。其次，该技术以非特异性的焦磷酸盐沉淀或荧光变化判读结果，因此难以实现高通量的多重检测。

5 展望

目前，RT-LAMP 法在流感病毒检测上的应用还较为有限。这一新型核酸扩增技术，具有扩增高效快速、特异性强、灵敏度高、步骤简单、鉴定简便、不需要昂贵仪器等优点，在流感病毒的临床检测技术上具有很好的应用前景，不仅可用于流感病毒的检测，还可以检测流感病毒耐药性基因，对于临床诊断用药和流感流行的监控具有重要的意义。

从目前流感临床快速检测的实际需求出发，研制核酸的快速抽提技术与 LAMP 方法相结合，实现从样本处理/核酸制备到 LAMP 扩增的系统快速检测；同时改进和完善LAMP 检测方法，提高其检测灵敏度的稳定性，并适应和满足当前流感多亚型、高通量以及耐药性和抗原突变等多种检测需求，将是未来一段时间重要的发展方向。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.007

国家重点基础研究发展计划（973 计划）（2010CB534002）；国家自然科学基金（81000722）

100071 北京，军事医学科学院微生物流行病研究所（刘娟、姜涛、秦鄂德、秦成峰）；100142 北京，空军总医院输血科（刘娟）

秦成峰，Email：qincf@bmi.ac.cn

2011-09-30