许四宏，王佑春

·生物诊断技术·

重大传染病诊断技术

许四宏，王佑春

近年来，我国在突发传染病，尤其是严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）和甲型H1N1 流感等的防控经验显示，诊断试剂在传染病的预防和控制中发挥着越来越重要的作用。这些诊断试剂从方法学上讲，主要分为两大类，即免疫学诊断和分子诊断。本文对这两类诊断技术进行简要综述。

1 免疫学诊断技术

免疫学诊断技术一般是以抗原抗体特异性反应为基础的检测技术，主要包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、免疫层析技术以及最近发展的以化学发光法、时间分辨荧光分析法等为代表的新型检测技术。

1.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）

1971 年，Engvall 和 Van Weemen 分别建立的酶联免疫吸附实验是经典的免疫学诊断技术，其基础是抗原或抗体的固相化（包被）及抗原或抗体的酶标记[1-2]。包被后的抗原或抗体保留免疫学活性，可与待测样品中的抗体或抗原形成免疫复合物；酶标记后的抗原或抗体可继续与抗原抗体复合物进一步形成复合物，复合物中的酶可催化酶的底物发生显色反应，其色度的深浅与待测样品中受检物质的量成正比。

根据反应中形成免疫复合物的种类，ELISA 可以分为4 类方法，即夹心法、间接法、捕获法和竞争抑制法。夹心法包括双抗原夹心法和双抗体夹心法，包被物为抗原（或抗体），以酶[一般为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）]标记的抗原（或抗体）为酶结合物。间接法的包被物为抗原，以酶（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的二抗为酶结合物。捕获法一般用于 IgM 抗体的检测，包被物为抗人 IgM 抗体，用于捕获待测样品中特异性或非特异性的 IgM 抗体，酶结合物为酶标记的针对特异性抗原的抗体。竞争抑制法是先将特异性抗原（或抗体）包被于微孔板，随后分为两组，一组仅加酶标记的抗原（或抗体），另外一组则同时加入酶标记的抗原（或抗体）和被测抗原（或抗体）的混合物，最后加入底物显色，通过两组底物显色的差异判定是否为阳性。

目前，ELISA 技术已广泛应用于重大传染病的诊断，如双抗原夹心法用于检测 HIV 抗体、双抗体夹心法检测HBsAg、间接法用于检测 HCV 抗体等。随着技术的不断发展，近年来，抗原抗体联合检测试剂也逐步在中国上市，比如国外 20 世纪末 21 世纪初研发成功的 HIV 抗原抗体联合检测试剂，就是利用双抗原夹心法检测 HIV 抗体的同时利用双抗体夹心法检测 HIV-1 p24 抗原，利用亲和素-生物素放大系统（avidin-biotin system，ABS）[3]尽可能在不影响检测 HIV 抗体性能的前提下，提高检测 HIV-1 p24 抗原的灵敏度。我国目前仅 2 家企业获得该种试剂的生产文号，还有至少 6 家企业正在申请注册。

1.2 免疫层析诊断技术

免疫层析诊断技术是 20 世纪 90 年代兴起的一种新型快速诊断技术，其基础是胶体金标记技术、层析技术和抗原抗体特异性反应。

1.2.1胶体金的标记 胶体金溶液是直径为 20 ～ 40 nm的金颗粒溶液，经氯金酸还原制成，其中心的金原子颗粒周围吸附了一层带负电的 AuCl2-离子，由于静电作用形成稳定的胶体金溶液。胶体金的标记一般可采用 3 种方式：①依赖于蛋白质上赖氨酸较强的正电荷，通过静电吸附结合于胶体金；②依赖于色氨酸的疏水作用与胶体金连接；③依赖于半胱氨酸的 –SH 与金表面以共用电子的形式形成共价键连接胶体金。

1.2.2硝酸纤维膜（NC 膜）层析技术 NC 膜主要用于蛋白质的包被，一般通过特定的喷膜仪完成。经表面活性剂处理后，NC 膜具有很好的亲水性，待测血清从 NC 膜的一端加入后，在毛细作用下，能在数十秒之内层析到 NC 膜的另一端，这种层析技术是胶体金快速诊断技术的基础。

1.2.3免疫层析诊断技术 免疫层析诊断技术中，标记的颗粒除了胶体金外，还包括胶体硒、乳胶颗粒、纳米磁珠等。胶体硒的性质与胶体金相似，可通过同样的方法进行标记。乳胶颗粒的标记一般通过疏水作用或化学交联的方法。

胶体金类免疫层析诊断试剂的优点主要体现在：快速（一般 5 ～ 30 min 即可观察到检测结果）、操作简单（不需要专业人员、实验室以及仪器）、稳定性好、成本低。其缺点是灵敏度低于 ELISA 试剂，使用范围应受到一定限制。

目前该技术已广泛应用于传染病的检测，如常规的乙肝五项检测项目、HCV抗体、HIV 抗体等检测项目。2009 年，我国有多家企业研制成功甲型 H1N1 流感抗原胶体金试剂，可快速对甲流进行诊断，为我国甲流的预防和控制发挥了比较重要的作用。

1.3 新技术在免疫诊断中的应用

近年来，随着科学技术的不断发展，多项新技术被广泛应用于免疫学诊断，其中以化学发光技术、时间分辨荧光分析法等为代表。

1.3.1化学发光技术 化学发光免疫分析法是 1977 年由Halmann 等[4]将高灵敏度的化学发光技术和抗原抗体的特异性反应相结合而建立，与 ELISA 技术不同，该技术采用化学发光显色系统。

依据标记物的不同，化学发光免疫分析法可分为 3 种：①标记物质直接发光，一般以吖啶酯类衍生物标记抗原或抗体，在过氧化氢和碱性条件下，产生高强度、低背景的闪光，但持续时间极短，因此对检测仪器有较高的要求；②酶促发光，主要为辣根过氧化物酶催化鲁米诺发光以及碱性磷酸酶催化 1, 2-环二氧乙烷金刚烷衍生物发光[5-6]。酶促发光产生的为辉光，持续时间较长，对检测仪器的要求较低，比较易于广泛推广应用；③电化学发光，一般以三联吡啶钌作为标记物，经电激发钌产生闪光[7]。

化学发光分析法结合 ELISA 技术中的夹心法、间接法的试剂目前均有研发成功，应用后两类发光技术的试剂已经在我国上市。我国有多家企业生产应用 HRP/鲁米诺酶促发光系统的乙肝 HBsAg、HCV 抗体、HIV 抗体试剂获准上市。应用电化学发光系统，法国生物梅里埃公司的 HIV 抗原抗体联合检测试剂 VIDAS HIV Duo、VIDAS HIV Ultro已在我国获准上市，罗氏诊断的 HIV 抗原抗体试剂已在我国获得注册。

1.3.2时间分辨荧光分析法 时间分辨免疫荧光分析法最早由芬兰的 Wallac 公司建立，与 ELISA 试剂不同，其标记物为 Eu3+标记的抗原或抗体，在荧光增强液的作用下，抗原抗体复合物上结合的 Eu3+离子从免疫复合物解离，迅速与荧光增强液中的配体螯合并进入疏水内核，使得半衰期较长的 Eu3+荧光得以成千万倍的放大，从而产生高灵敏度的免疫分析。

目前我国苏州新波生物技术公司和广州达瑞公司均以时间分辨荧光免疫分析法技术为研发基础，已有多种传染病诊断试剂，如 HBsAg、HCV 抗体、HIV 抗体试剂等获准上市。

2 分子诊断技术

早期的分子诊断技术是采用核酸杂交技术对目的核酸进行检测。随着分子生物学的发展，分子诊断技术越来越多地应用于传染病的临床诊断，如运用多种扩增放大技术，将低拷贝的靶序列成对数级放大扩增，同时采用比放射性探针更灵敏的非放射性检测系统（如电化学发光系统、实时荧光系统等），大大提高了核酸检测的敏感性，并减少了放射性物质的使用。当前应用的分子诊断技术主要包括 3 种类型，即靶扩增、探针扩增和信号扩增，但是目前我国市面上的分子诊断试剂主要应用技术仅包括靶扩增和信号扩增，因此本文仅对该两项技术的应用进行综述。

2.1 靶扩增

于 1983 年建立的 DNA 聚合酶链反应（ploymerase chain reaction，PCR）是分子诊断技术的基础[8]。随后研究者们开发出了多种核酸扩增技术，其主要区别在于扩增条件、扩增酶的类型及是否需要温度变化循环等方面，不同方法的扩增时间也存在很大差异。靶扩增技术主要包括 DNA聚合酶链反应、以转录为基础的扩增以及环介导的等温扩增。

2.1.1DNA聚合酶链反应 该技术是利用耐热的 DNA聚合酶及与靶序列上某区域上下游的两条寡核苷酸引物（序列长度一般为 15 ～ 30 bp）对该靶序列进行扩增。其反应一般包括 25 ～ 35 个循环，每个循环包括 3 个温度阶段，分别完成变性、退火和延伸功能。在此基础上发展起来的实时荧光PCR（RT-PCR）技术，即是以 RNA 为靶，先采用逆转录酶将 RNA 逆转录为 cDNA 链，然后以该 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。

PCR 结束后，可以采用多种不同的检测技术对扩增的靶序列进行检测。早期的检测技术是采用类似于 ELISA 式的方法进行检测，如 Roche 公司的 COBAS Amplicor HIV-1 monitor test 和 COBAS HBV monitor test 试剂，该类试剂在两条 PCR 引物的 5' 末端均标记有生物素，利用具有逆转录和 DNA 聚合酶活性的重组 DNA 聚合酶（rTth Taq酶）经 PCR 扩增后，以亲和素标记的 HRP 催化四甲基联苯胺（TMB）显色，最后通过设定的公式计算出标本中所含 HBV DNA 或 HIV-1 RNA 的数量。

随着 RT-PCR 技术的发展，已有多家企业开发完成RT-PCR 试剂。其基本原理是：设计合成一条能与 PCR 产物杂交的寡核苷酸探针，该探针的 5' 端标记荧光报告基团，3' 端标记荧光淬灭基团；在两者距离很近且在同一寡核苷酸探针上时，3' 端淬灭基团吸收 5' 端荧光报告基团的荧光，因而检测不到 5' 端荧光报告基团发出的荧光；但当溶液中存在 PCR 产物（模板）时，该探针与模板退火，产生适合于核酸外切酶活性的底物，Taq 酶则利用 5' → 3' 核酸外切酶活性，将探针 5' 端的荧光报告基团从探针上切割下来，破坏了两个荧光分子间的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），从而发出荧光，随 PCR 的反复进行，PCR 产物成倍累积，荧光探针也成倍被水解，荧光信号强度的增加将进入指数增长期，因此，根据 PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。目前实时荧光 PCR（RT-PCR）试剂主要包括：Roche公司的 Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HIV-1 test version 1.0 和 version 2.0、Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV test version 1.0 和 version 2.0、Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HCV test version 1.0 和 version 2.0；Abbott 公司的RealTime HIV-1 assay、RealTime HBV assay、RealTime HCV assay 等，这些试剂均采用自动化的样品处理平台以处理待测样品提取核酸，大大减少人工操作可能带来的误差，同时大大节省了人工，提高了试剂的通量。

近年来，HBV/HCV/HIV-1 核酸联合筛查试剂是一个研究热点，多家企业研发成功基于实时荧光PCR（RT-PCR）的定性筛查试剂。我国该类试剂主要包括： HBV/HCV/HIV分别单管扩增的试剂（上海科华生物工程股份有限公司和中山达安公司）和一管联合扩增多色荧光 PCR 试剂（上海浩源生物科技有限公司）。

2.1.2以转录为基础的扩增 以转录为基础的扩增（transcription-based amplification system，TAS）技术使用逆转录酶合成 cDNA，同时使用 RNA 聚合酶合成 RNA。其基本原理为：设计 A、B 两条引物，引物 A 的 3' 末端与待扩增的 RNA 靶区互补，其 5' 端含有 T7 RNA 聚合酶的启动子；逆转录酶以 A 引物为起点合成 cDNA；引物 B与此 cDNA 的 3' 端互补合成 cDNA 第二链；逆转录酶除具有逆转录活性外，还有 DNA 聚合酶的活性及 RNase H的活性；T7 RNA 聚合酶又以此双链 DNA 为模板，转录出与待扩增 RNA 一样的 RNA，这些 RNA 又可作为下轮RNA 扩增反应的模板。T7 RNA 聚合酶的催化效率很高，理论上一个模板可转录 10 ～ 103个 RNA 拷贝，因而反应液中待检 RNA 的数量以 10 的指数方式扩增。

目前利用该技术的试剂主要包括生物梅里埃公司的以NASBA 技术为基础的NucliSENS HIV-1 QT 和 NucliSENS easyQ HIV-1 试剂以及 GeneProbe 公司的以 TMA 技术为基础的 HBV/HCV/HIV-1 检测试剂，两者进行核酸扩增的不同之处主要在于逆转录酶，NASBA 技术采用 AMV 逆转录酶，而 TMA 试剂采用莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶。

NucliSENS HIV-1 QT 试剂采用硅胶提取核酸，运用NASBA 技术进行扩增，同时利用电化学发光技术进行终点检测。检测时，HIV-1 RNA 和内标采用不同的探针进行杂交，扩增产物和金属钌标记的探针形成的杂交复合体磁珠被电极所捕获，引发电化学发光反应。探针发出的光与扩增产物的数量成比例，所产生的光的量直接代表着反应物中钌的量，其动力范围至少为 6 个数量级。

NucliSENS easyQ HIV-1 试剂则是采用磁性硅颗粒提取核酸，运用 NASBA技术进行扩增，同时运用靶特异的分子信标进行实时检测。检测时，采用两个不同的分子信标，分别针对 HIV-1 RNA 的扩增子和内标 RNA Calibrator 的扩增子，两者均为包含一段可特异结合 HIV-1 RNA 或内标RNA Calibrator 序列的 DNA 寡核苷酸。两个分子信标5' 端分别连接两个不同的荧光基团，3' 端均连接淬灭基团。当靶 RNA 互补链不存在时，分子信标维持内部发夹结构，使淬灭基团处于非常接近荧光素的位置，荧光信号被淬灭。当分子信标与靶序列互补结合，发夹结构打开并释放荧光信号，系统结果报告为存在靶序列[9-10]。荧光信号的动力学分析可以显示 HIV-1 RNA 和内标物 RNA 的转录速率，因此可以计算出样本中 HIV-1 RNA 数量[11-14]。目前 NucliSENS easyQ HIV-1 试剂在我国注册的共有两个版本，v1.1 版本和v2.0 版本，v2.0 版本改进了试剂的引物，以增加对不同基因型 HIV-1 RNA 的包容性[15]。

采用 TMA 技术的试剂主要包括诺华公司申请注册的HBV/HCV/HIV-1 检测试剂（Ultra 试剂）。该试剂核酸提取采用结合有特异的寡核苷酸的磁珠，检测时，采用的是双动力学化学发光检测。通过在扩增产物中加入与 RNA 扩增子互补的 AE 分子标记的探针（内标特异性探针标记的为闪光发光分子 Ortho-flroro-AE，病毒特异性探针标记的为辉光发光分子 1-methyl-AE），60 ℃ 孵育可使探针与可能存在的病毒和内标扩增子进行杂交，形成双链分子。由于两种AE 分子具有不同的发光特性，闪光型分子在发光试剂的作用下，会迅速发出相对强烈的光，延续时间很短（毫秒级）光强度会很快下降；而辉光性分子在发光试剂作用下，却可以缓慢发出一定强度的光，持续时间较长（秒级），利用化学发光检测仪，在样品加入发光试剂后对样品管的发光情况进行连续检测（50 次/2 秒），可以绘制光强度曲线，通过软件对数据进行处理，可以对内标的结果及是否存在病毒核酸进行判断。

2.1.3环介导的等温扩增 环介导的等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）是由日本学者Notomi 等[16]于 2000 年开发的一种新型核酸扩增技术，根据针对不同靶序列设计的两对特殊的内、外引物，即正向内侧引物（forward inner primer，FIP）、正向外侧引物（forward outer primer，F3）、反向内侧引物（backward inner primer，BIP）、反向外侧引物（backward inner primer，B3），特异性识别靶序列上的 6 个独立区域，利用链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA 聚合酶），在 60 ～ 65 ℃ 温度范围启动循环链置换反应，内引物杂交在目标 DNA 区，启动互补链合成，导致哑铃状 DNA 产生，这种结构很快以自身为模板，进行 DNA 合成延伸，形成茎-环 DNA 结构，然后以此结构作为 LAMP 循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成的 DNA 产生一个有缺口的茎-环 DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环 DNA 混合物（图1），从而在较短时间内实现对核酸的大量有效扩增，形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过肉眼观察颜色变化判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究。2009 年甲型 H1N1 流感流行时，国内有个别企业即运用该技术研制成功H1N1 核酸诊断试剂。目前国内也有部分企业运用该技术研制开发一些病原体分子诊断试剂，如结核杆菌、HBV 等。

图1 LAMP技术原理

2.2 信号扩增

该技术通过将 Sandwich 杂交技术和信号扩增技术偶联来检测液态介质中的 RNA 或 DNA。典型的信号扩增技术主要为 Branched DNA（bDNA）技术，其核心是由若干组相关联的人工合成寡脱氧核苷酸组成的探针系统。第一组探针称为 5' 端标记生物素的捕获探针，可与已预先包被在介质（如微孔板、琼脂糖珠）上的亲和素特异结合。第二组探针 3' 端一段序列与捕获探针互补，其余序列与病毒基因组上不同区域互补。第三组探针与第二组相似，在杂交过程中，一端与靶分子特异结合，另一端则与放大探针互补。放大探针（即分枝链探针）的一级结构呈钗状或疏状，在钗柄（即主链的一端）连接了 45 根由 18 个寡核苷酸组成的分枝链，主链的其余部分则是可与第三组探针互补的序列。第五组探针与第四组探针的分支链互补，另一端用 AP 修饰。通过 AP 酶促化学发光的原理进行信号检测，以发光信号的强弱判定待测标本中病毒基因组含量，发光信号经系列探针逐级放大，敏感度比 AP 直接加底物显色后的 OD 值大大提高。bDNA 技术的核心和关键是探针，其制备是一个比较复杂的过程。

目前应用 bDNA 技术，已经上市的试剂主要有西门子公司 HIV-1 bDNA 3.0试剂。

3 展望

综上所述，重大传染病病原体的诊断技术发展很快，不断有新方法以及新技术应用于病原体的诊断，而且目前的发展趋势是将几种方法优化后整合到一种诊断试剂中，使试剂的敏感性以及特异性明显增强。尤其近几年新发或突发传染病不断爆发，对诊断试剂简便、快速、准确的要求，又进一步促进了诊断技术的发展。相信随着科学技术的发展以及实际需求的提高，现有的诊断技术也将会不断地改进和提高，以满足实际需要。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.06.005

“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项（2009ZX10004-801）

100050 北京，中国食品药品检定研究院

王佑春，Email：wangyc@nifdc.org.cn

2011-11-14