常 明 刘书馨 刘 焱 王志宏 付 瑶 (大连市中心医院肾内科，辽宁 大连 116033)

近年来的研究表明，p16基因(细胞周期蛋白激酶抑制物基因)不仅是一种抑癌基因，也是人类细胞衰老的主导基因。它在衰老细胞中的表达比年轻细胞高10～20倍，是细胞衰老的标志物之一。抑制p16基因表达，不仅细胞衰老速度减慢，寿命延长，而且端粒长度缩短也减慢;反之，增加p16基因表达，不仅细胞衰老速度加快，寿命缩短，端粒长度缩短也加快，提示调控p16的表达直接影响某些细胞的寿命〔1〕。肾脏功能随年龄增长逐渐下降。肾脏衰老在病理上表现为肾小球硬化、肾间质纤维化和肾动脉硬化，但缺乏特征性改变和特异性标志物，限制了肾脏衰老机制的研究。鉴于p16在细胞衰老中的重要作用，我们推测p16可能是肾脏衰老的标志之一。因此，本研究以p16为切入点，从基因和蛋白质水平观察p16在大鼠肾脏随增龄表达的变化，为进一步探讨肾脏衰老的机制寻求理想的衰老标志物。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 大鼠p16引物由北京赛百盛公司合成、小鼠p16单克隆抗体(美国Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ⅠgG(美国Santa Cruz)、PCR试剂(TaKaRa生物工程大连有限公司)、ECL显色试剂(美国 Santa Cruz)、PTC-200 DNA合成仪(美国MJ Research)、SYBR GREENⅠ染料(美国Molecular Probes)、ⅠCYCLER荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)、MⅠNⅠ-PROTEⅠN2 电泳仪(美国 Bio-Rad 公司)、ALPHAⅠMAGER2200凝胶图像分析系统(美国Alpha公司)。

1.2 实验动物及标本留取 取1日龄、3月龄和24月龄雄性Wister大鼠(由大连医科大学动物中心提供)各6只，以2%戊巴比妥(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉，取腹正中切口，分离双侧肾脏，去包膜留取肾组织，肾组织分为2份，1份以10%中性甲醛固定，用于制备石蜡切片，1份置于液氮冻存以提取 RNA和蛋白。……