张明明 帖彦青 马 倩 宋光耀 孙海娟 郝志华 王俊明

(河北省人民医院检验科,河北 石家庄 050051)

胆固醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)是协调脂质转运的重要蛋白,与血脂水平及血浆中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平、成分组成及颗粒的大小均密切相关〔1〕,在胆固醇的代谢中具有非常重要的作用。某些基因多态性可以改变CETP的活性及功能,对脂代谢产生影响,从而影响动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生与发展。迄今发现的CETP多态位点至少包括启动子区 11个、内含子 21个、外显子 16个,其中以 D442G和R451Q最为常见。但迄今关于 CETP基因多态性与血清胆固醇水平的关系尚不完全明确,故本研究应用PCR-RFLP技术检测 CETP基因 D442G突变在不同人群的基因频率和基因型频率,同时测定血清CETP浓度、血脂水平,探讨 D442G突变与血浆胆固醇水平的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 730例胆固醇异常患者均来自我院体检中心,排除了 LDL-R、ApoB100基因突变。按照 2007年“中国成人血脂异常防治指南”标准〔2〕,分为:(1)高胆固醇血症组(HC组)446例,总胆固醇(TC)≥6.22 mmol/L(240 mg/dl)和甘油三酯(TG)＜1.7 mmol/L,其中男 290例,女 156例;年龄 36～58岁,平均(46.81±10.40)岁;(2)边缘高胆固醇血症组(BHC组)284例,5.18 mmol/L＜TC＜6.19mmol/L(200mg/dl＜TC＜239mg/dl)和 TG＜1.7 mmol/L,其中男 165例,女 119例,年龄34～59岁,平均(45.56±10.24)岁。同时收集对照组(NC组)187例,TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl),且 LDL-C＜3.12 mmol/L,其中男 100例,女 87例,年龄 35～59岁,平均(46.07±10.35)岁。血脂异常均为初次诊断,且未用任何降脂药物。所有研究对象常规检查均未发现异常,且所有受试对象均除外影响脂类代谢的疾病,排除应用影响糖脂代谢药物者。

1.2 方法

1.2.1 一般指标 测量身高、体重、腰围和血压,计算体重指数(BMI)=体重(kg)/身高(m2)。

1.2.2 血脂测定 体检人群过夜空腹 12 h,次日清晨抽取肘静脉血,留取 4ml,置于促凝管中,分离血清,待测血脂;另取4 ml置于EDTA抗凝管中,-80℃低温冰箱中保存,用于提取DNA。 TC、TG、HDL-C采用酶法测定,由 Beckman全自动生化分析仪测得,LDL-C按 Friedwald公式计算得出,LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.2.3 ELISA检测 CETP浓度 CETP试剂盒E0814h由武汉晶美生物有限公司提供,最小可测人CETP浓度为 0.78 ng/ml;板内、板间变异系数均 ＜10%。依据试剂盒的说明书操作,测定血清中 CETP浓度。

1.2.4 CETP基因的多态性分析(PCR-RELF) (1)人基因组DNA的提取:EDTA抗凝血 400μl,按照天根 TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书提取基因组 DNA。(2)PCR扩增LDL-R基因目的片段:引物设计采用生物学软件 Primer5.0,并与 GenBank进行比对。序列为:上游引物 5′-AGCAAAGGCGTGAGCCTCTCCG-3′,下游引物 5′-AGGAGGGAGCCAAGCTGGTAGA-3′。上游引物 P3设计时将其 3′端第 3个碱基设计为 C,而模板为 T,当 CETP基因第 1506位碱基由A突变为G时,就形成了 MspⅠ酶切位点,PCR产物长度179 bp。 PCR反应体系:共 20 μl,包括:KOD plus(5U/μl)0.5μl、上下游引物各 1 μl、基因组 DNA 1 μl、dNTP Mixture 1 μl、buffer 2μl、ddH2O 13.5 μl。 PCR反应采用降落聚合酶链反应技术,反应条件见文献〔3〕。琼脂糖电泳鉴定 PCR产物。(3)PCR反应产物的限制性片段长度多态性分析:PCR产物用限制性内切酶 MspⅠ进行酶切,反应体系共 20μl,包括 PCR扩增产物 5μl,限制性内切酶 1μl,Buffer 2μl以及双蒸水。于37℃水浴酶切 4 h,加入 buffer 2μl终止反应。酶切产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶(8%PAGE-Gel)电泳,100 mV,50 min,并与Marker比较,用 UVPGD-8000凝胶图像分析系统鉴定,照相。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件。计量资料采用±s表示,多组比较采用单因素方差分析,基因频率采用基因计数法计算;组间基因型与等位基因频率比较采用 χ2检验,Logistic回归分析 CETP基因多态位点与血清胆固醇水平升高的关系。

2 结 果

2.1 三组血脂及CETP浓度的比较 三组年龄、性别均匹配,BMI在正常组、高胆固醇血症组、边缘高胆固醇血症组依次升高,差异有统计学意义(均 P＜0.05),HDL在正常组、边缘高胆固醇血症组、高胆固醇血症组依次降低,CETP浓度依次升高,差异有统计学意义(均P＜0.05),见表 1。

表1 三组血脂及CETP浓度的比较(±s)

表1 三组血脂及CETP浓度的比较(±s)

与 NC组比较:1)P＜0.05,与 BHC组比较:2)P＜0.05;表 2同

指标 NC组(n=187)BHC组(n=284)HC组(n=446)年龄(岁) 46.41±10.45 46.38±10.63 47.01±11.05 BMI(kg/m2) 23.76±2.34 25.14±3.021) 25.04±2.481)TC(mmol/L) 4.36±0.51 5.66±0.431) 7.99±0.781)2)TG(mmol/L) 1.02±0.31 1.09±0.31 1.10±0.37 HDL(mmol/L) 1.42±0.29 1.27±0.371) 1.09±0.361)2)LDL(mmol/L) 2.42±0.48 4.21±0.611) 5.47±0.791)2)CETP(mg/L) 1.65±0.78 2.18±1.211) 2.48±1.391)2)

2.2 CETP基因D442G突变基因型的判定

2.2.1 PCR-RFLP分型 根据限制性内切酶 Msp I的酶切情况,表现为DD基因型、DG基因型和 GG基因型。PCR产物为179bp,DD野生型因无酶切位点仍为 179 bp,DG杂合子为179bp和 159 bp两个片段,GG突变纯合子有 Msp I酶切位点,为 159 bp的 1条带。见图 1。

图1 CETP基因第 15外显子MspⅠ酶切后的电泳结果

2.2.2 DNA序列分析 经过酶切分型后,取 PCR产物进行测序。D442G突变是CETP基因第 15外显子 1506位核苷酸发生A→G错义突变,上游引物 3′端第 3位设计引入 T→C错配碱基以形成 Msp I酶切位点(C↓CGG)。若为突变型(A→G)则有Msp I酶切位点。以上均经DNA测序证实了酶切分析的位点准确性。见图 2。

图2 CETP基因D442G突变的DNA测序结果

2.3 CETP基因D442G突变基因型和等位基因频率分布 在对照组中未发现 D442G突变的纯合子 GG型,而HC组和BHC组中均发现D442G突变的纯合子GG型。三组D442G突变GG基因型及 G等位基因的分布差异有统计学意义(P＜0.05),HC组中 GG基因型及 G等位基因频率明显高于其余两组(P＜0.05)。见表 2。

表2 CETP基因 D442G突变基因型和等位基因频率分布〔n(%)〕

2.4 CETP基因D442G突变不同基因型间血脂与 CETP浓度比较 HC组 GG基因型者与 DG基因型、DD基因型比较,其血清 TC、HDL-C、LDL-C水平有逐渐下降的趋势,CETP水平有逐渐上升的趋势,其中 TC、CETP、LDL-C水平差异有统计学意义(P＜0.05),HDL-C水平在三组之间差异没有统计学意义(P＞0.05)。BHC组和对照组 DG基因型的TC、LDL-C均高于DD基因型,CETP浓度低于DD基因型(P＜0.05),HDL-C水平高于 DD基因型(P＞0.05)。见表 3。

2.5 CETP基因D442G突变与HC的关系 以TC作为应变量(Y),以性别、年龄、BMI、TC、TG、HDL和 CETP基因 D442G基因型为自变量(X)进行多因素 Logistic回归分析,发现 CETP基因 D442G突变 GG基因型(OR=2.60,95%CI 1.418～4.764,B=0.955,SE=0.309,Wald=9.552,P=0.002)是高胆固醇血症的独立危险因素。

表3 CETP基因 D442G突变不同基因型间血脂和CETP浓度的比较(±s)

表3 CETP基因 D442G突变不同基因型间血脂和CETP浓度的比较(±s)

与 DD基因型比较:1)P＜0.05,与 DG基因型比较:2)P＜0.05;与GG基因型比较:3)P＜0.05

指标 HC组(n=446)DD DG GG BHC组(n=284)DD DG GG NC组(n=187)DD DG GG TC(mmol/L) 7.31±1.20 11.1±0.931) 12.51±1.871)2) 5.88±0.23 6.17±0.021) - 4.23±0.30 4.77±0.021) -TG(mmol/L) 0.98±0.29 1.00±0.33 0.99±0.38 0.99±0.27 0.93±0.37 - 1.01±0.33 1.02±0.10 -HDL(mmol/L) 1.20±0.30 1.24±0.36 1.31±0.38 1.22±0.39 1.37±0.29 - 1.19±0.07 1.27±0.20 -LDL(mmol/L) 5.60±1.33 9.52±1.261) 10.86±1.911)2) 4.02±0.49 4.28±0.251) - 2.45±0.42 3.31±0.751) -CETP(mg/L)2.61±1.243) 2.46±1.223) 2.29±0.51 2.34±1.18 2.17±1.13 - 1.92±1.16 1.58±1.07 -

3 讨 论

高胆固醇血症可导致多种疾病,故与其相关的CETP基因研究也日益受到重视。CETP基因长度为25 kb,位于人类16号染色体长臂(16q12～21),包含 16个外显子和 15个内含子〔4〕,编码产物 CETP在胆固醇逆向转运中起关键作用〔5〕。CETP影响 HDL和 LDL颗粒大小的分布,是参与 HDL代谢和决定HDL、LDL水平的重要因素〔6,7〕。CETP基因的改变将影响其蛋白水平的表达,从而影响脂质的代谢,进而对与脂质密切相关的疾病产生影响。

王永志〔8〕等研究发现在高胆固醇血症患者中 CETP的浓度和活性有显著变化,对脂代谢起到重要的调节作用。本研究CETP在高胆固醇血症组与对照组有显著性差异验证了这一观点。而且在本研究中 DD、DG、GG三种基因型 CETP的浓度也存在显著差异,DD型纯合子的CETP浓度明显高于其余两种基因型,提示CETP基因D442G基因突变影响 CETP的浓度和活性。

CETP基因的 D442G突变是第 15外显子的错义突变442Asp→Gly(D442G),即 cDNA第 1506位碱基 A→G转换突变,导致第 442位天冬氨酸(Asp)被甘氨酸(Glv)替代。由于突变位点靠近脂质转运活性中心,影响 CETP的合成及活性,D442G在降低CETP水平的同时,还能升高 HDL-C水平。有资料证实日本是目前 CETP基因缺陷最为频发的国家〔9〕,中国人该基因变异频率略低于日本〔10〕,但在欧美白种人和印度人未发现该基因突变〔11〕。故本研究对CETP基因的 D442G突变进行了分析,结果发现三组人群中 HC组和BHC组均检出 CETP基因 D442G突变GG突变纯合子,而在对照组中则未检出,与郑克勤〔12〕的研究结果一致;而 HC组 D442G突变频率为 5.3%,与王伟〔13〕报道的突变率为 6%相接近。本研究还显示 HC组中GG基因型及 G等位基因频率明显高于其余两组。在 HC组中,GG基因型者血清 TC、LDL-C水平较其他两组有上升趋势,CETP水平有下降趋势;回归分析显示高胆固醇的主要危险因素是 CETP基因 D442G突变GG基因型。以上都说明 CETP基因的D442G突变与高胆固醇血症关系密切,但该突变如何调控胆固醇生成尚待进一步研究。

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13 王 伟,周 新,刘 芳,等 .胆固醇酯转运蛋白基因 TaqIB多态性、D442G突变与冠心病的相关性研究〔J〕.中华心血管病杂志,2004;32(11):981-5.