于俊娜 牛文彦

骨骼肌是摄取葡萄糖维持血糖稳态的重要器官，胰岛素和骨骼肌收缩以不同的信号机制促进胞浆中的葡萄糖转运子4（glucose transporter 4，GLUT4）转位到细胞膜上增加葡萄糖摄取量[1]。氨乙酰胆碱（Carbachol，Cch）是乙酰胆碱的稳定类似物，可去极化骨骼肌细胞膜，造成收缩[2]。在培养的小鼠C2C12骨骼肌细胞中使用Cch可模拟运动的作用[3]。Ca2+通过许多钙敏感激酶进行信号传导。本研究通过测定C2C12小鼠骨骼肌细胞膜上的GLUT4myc的水平和钙-钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）的磷酸化水平，探讨CaMKⅡ在收缩的骨骼肌细胞中促进GLUT4myc转位的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 C2C12 GLUT4myc骨骼肌细胞株由本实验室建立，Hanks液、DMEM（天润善达公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），马血清（美国Gibco公司），Blasticidin-HCl（德国Calbio⁃chem公司），抗myc抗体（美国Sigma公司），偶联辣根过氧化物酶（HRP）的山羊抗兔抗体（美国Jackson Immuno Research公司），抗磷酸化CaMKⅡ抗体（美国Cell Signaling公司），偶联HRP的山羊抗兔抗体、驴抗鼠IgM抗体（美国Jack son Immu⁃noResearch公司），增强化学发光底物检测试剂盒（美国Milli⁃pore公司）。KN93、KN62（加拿大Calbiochem公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃，体积分数为0.05的CO2条件下培养C2C12 GLUT4myc成肌细胞，将成肌细胞接种到培养板中，用含5%马血清的DMEM高糖培养基诱导分化为多核肌管，每2 d换液，于第5天用于实验。将培养板中的细胞无血清培养4 h后随机分为对照组和Cch组，分别加入无血清培养基或100 μmol/L的Cch孵育10 min。各组分为抑制剂亚组和对照亚组，分别用于测定细胞膜上GLUT4myc的水平及检测CaMKⅡ的磷酸化。

1.2.2 酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞膜上GLUT4myc的水平 抑制剂亚组加入10 μmol/L抑制剂KN93或KN62于处理前30 min预孵育细胞。……