任 娜,吴 璐,李 贲,张 婷,田梅梅,张锦前,成 军,李 鑫

首都医科大学附属北京地坛医院,北京 100015

既往相关研究发现,HCV感染与糖尿病、移植后糖尿病、地中海贫血患者伴发的糖尿病或糖代谢异常均有相关性[1]。而且,肝脂肪变的存在与慢性丙型肝炎(CHC)的疾病进展有关[2]。Mason等[3]指出丙型肝炎病毒(HCV)感染与糖尿病(DM)密切相关。HCV包膜糖蛋白NS4B是一种多功能蛋白质,与HCV感染的慢性化和抗病毒免疫关系密切。因此我们应用酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞cDNA文库中HCV NS4B的结合蛋白基因,为研究HCV慢性感染与胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)、肝脏脂肪变性、代谢综合征(metabolic syndrome,MS)之间的相关性及其作用机制提供研究依据和方向。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂及培养基:YPDA SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基均购自美国Clonteeh公司。酵母双杂交系统3试剂盒:包括人胰腺细胞cDNA文库、pGADT7-AD克隆载体、pGBKT7-BD克隆载体、pGADT7-T对照质粒、pGBKT7-53对照质粒、酵母菌株AH109、酵母菌株Y187,购自美国Clonteeh公司。引物合成由北京奥科生物技术公司完成。

1.2 方法

1.2.1 酵母胰腺细胞cDNA文库的构建:按试剂盒说明书对文库进行扩增,纯化文库质粒后转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,随机挑取6个单克隆提取质粒, EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定cDNA文库的多样性。然后将该文库转化酵母菌株 Y187,制备酵母胰腺细胞cDNA文库。提取新鲜生长的Y 187酵母菌落(直径＞2mm)接种于150 mLYPDA液体培养基中,30℃振摇培养至A600＞1.5时,把该培养物转摇至850 mL YPDA液体培养基中,30℃振摇培养至 A600=0.4～0.6。以醋酸锂法将胰腺细胞cDNA文库质粒(0.25 mg)转化入酵母菌株Y187进行文库转化,然后将转化物铺SD/-Leu板50块,30℃倒置温育7 d。同时将转化产物按 1∶10、1∶102、1∶104、1∶106和 1∶108分别铺于SD/-Leu培养基上检验转化效率。……