陈建华,余永胜,奚 敏,江 红,臧国庆,汤正好

1.苏州大学医学部,江苏苏州 215213;2.上海交通大学附属第六人民医院感染病科

较弱的CTL反应可能是导致HBV感染慢性化的主要原因[1-5]。

泛素-蛋白酶体系统是细胞内重要的蛋白质降解途径,抗原泛素化是MHC-Ⅰ类分子提呈所必需的环节[6]。

HBV慢性感染者中树突状细胞(dendritic cells, DC)抗原提呈能力低下,造成细胞免疫低下[7]。因此,本研究主要通过构建携带强制泛素化HBcAg基因的慢病毒表达载体,并包装成重组慢病毒,研究其对体外培养的小鼠树突状细胞成熟的诱导能力,期望能得到成熟DC以用于抗HBV感染。

1 材料与方法

1.1 材料 携带有泛素-HBcAg基因质粒pcDNA3.1 (-)-Ub-HBcAg和携带有完整HBcAg基因质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg由本实验室构建保存[8];慢病毒骨架质粒pWPXLd、包装质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G和人胚肾上皮细胞系 293T细胞由南京医科大学李建民教授提供;感受态菌株DH 5α购自TIANGEN公司; RT-PCR试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNA分子量标记均为TaKaRa公司产品;限制性内切酶BamHⅠ、MluⅠ均购自New England Biolabs公司;无内毒素质粒小抽试剂盒为QIAGEN公司产品;DMEM细胞培养基及优质胎牛血清购自Gbico公司;Lipofectamine 2000转染试剂盒为Invitrogen公司产品;鼠抗人HBcAg单克隆抗体及羊抗鼠IgG-HRP为SANTA CRUZ公司产品;Western试剂购自碧云天公司;重组鼠GM-CSF和重组鼠IL-4为美国Peprotech公司产品;FITC标记的小鼠CD11c、CD86、CD 80和MHC-Ⅱ类分子单克隆抗体及小鼠IL-12 ELISA试剂盒为ebioscience公司产品;引物合成及测序分析由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2 Ub-HBcAg基因片段的扩增 以pcDNA3.1 (-)-Ub-HBcAg为模板,设计引物P1、P2,上游引物P1中含BamHⅠ酶切位点,下游引物P2中含MluⅠ酶切位点。rTaq DNA聚合酶扩增Ub-HBcAg基因片段。50μL体系反应条件如下:94℃×5 min;94℃×1 min,58℃×40 s,72℃×45 s,30个循环;延伸72℃×10 min。……