牟韶娇,盛剑秋,谢 惠,金 鹏,陆晓娟,高 巍

1.北京军区总医院消化内科,北京 100700;2.山西医科大学

流行病学研究表明,雌激素替代治疗能明显降低大肠癌发病率[1-3]。但雌激素对大肠癌预防作用的具体机制仍不明确。DNA错配修复(mismatch repair, MMR)系统在维持基因组稳定性中起关键作用,其主要功能为修复DNA复制过程中出现的错配和插入-缺失环(insertion-deletion loops,IDLs)。我们在前期工作中发现,雌激素对结肠细胞 MMR系统的影响可能是其预防大肠癌的机制之一,并观察到雌激素能上调结肠细胞 MMR基因表达[4]。本研究将构建细胞MMR活性检测平台,进一步探索雌激素对结肠细胞MMR活性的影响。

1 材料与方法

1.1 pEGFP-N 1质粒的改造

1.1.1 使用dam-感受态ER2925(美国NEB公司)去甲基化处理pEGFP-N1质粒(由国家人类基因组北方研究中心诺赛基因公司惠赠,序列详见:https://www. lablife.org/ct?a=viewvecseq＆vectorid=350)。用限制性内切酶StuⅠ和SexAⅠ(美国NEB公司)双酶切pEGFPN1,去除包括SV40复制起点上下游的DNA片段(230 bp),琼脂糖凝胶电泳回收并纯化酶切后所得的大片段(约4.5 kb,柱离心型DNA凝胶回收与纯化试剂盒,北京威格拉斯生物技术有限公司,Lot#101BC,按试剂盒说明书进行),Klenow酶(美国NEB公司)补平大片段,T4连接酶(西班牙Fermentas公司)环化。转入dam+感受态DH5α(由国家人类基因组北方研究中心诺赛基因公司惠赠),纯化(柱离心型高纯质粒小量提取试剂盒,北京威格拉斯生物技术有限公司,Lot#102AE,按试剂盒说明书进行)后测序和酶切验证。

1.1.2 利用PCR定点诱变(PCR-based site-directed mutagenesis)技术,在质粒上EGFP基因的起始密码子ATG的上下游插入限制性内切酶EcoRⅤ和NruⅠ的酶切位点。引物序列:5′-ggtggcgaccgggatatcccgggccc-3′,5′-atggtgagcaatcgcgaggagctgttc-3′(下划线部分分别为EcoRⅤ和NruⅠ的酶切位点,引物由北京奥科生物技术公司合成)。……