陈 宁，覃 霞，朱 樑

1．第二军医大学附属长征医院消化内科，上海200003;2．中国人民解放军海军北海舰队航空兵莱阳场站卫生队

肝细胞具有多种功能且代谢旺盛，离体培养的大鼠肝细胞用于毒理学、药理学、生物化学及致癌作用等研究有许多优点。目前，哺乳动物原代肝细胞的分离培养技术已被广泛应用于肝细胞介导的基因治疗与生物人工肝支持系统等方面［1］及其他生物医学领域。肝细胞在体外能否培养成功，分离技术至关重要。常用的分离方法主要有:机械法(包括直接分离法、振荡法等)和酶法(包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法)。其中用胶原酶在体内灌注肝脏的方法分离大鼠肝细胞生长良好，并且能获得高产率的完整细胞。本实验对胶原酶灌注法进行一些改进，发现在体内肝脏灌注分离大鼠肝细胞同样能获得高活率、高产率的细胞，在实验条件下肝细胞体外原代培养生长良好。

1 材料与方法

1．1 实验动物 选用雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量约180～250 g，购自上海第二军医大学动物实验中心。喂饲标准大鼠饲料，自由饮水，并按照动物饲养环境控制参数调节温度和湿度，12 h昼夜轮回。

1．2 实验材料与仪器 DMEM-F12培养液(HyClone公司)、胎牛血清(GIBCO公司)、Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)、D-hanks液(长征医院中心实验室自行配制)、PAS染色试剂盒(上海源叶公司)、鼠尾胶原(杭州生友公司)、双抗(GIBCO公司)。恒流泵(HL-2D型，上海青浦沪西仪器厂)、手术器械(上海医疗器械股份有限公司)、超净工作台HF-Safe 1500(上海力申科学仪器有限公司)、CO2培养箱(美国Revco公司)、水平高速低温离心机5810R(德国Eppendorf公司)、倒置光学显微镜(日本Nikon公司)。

1．3 肝细胞的分离［2-4］取大鼠，乙醚吸入麻醉后，腹腔注射7%的水合氯醛10 min后背位固定大鼠，常规消毒铺巾，U形开腹;暴露并游离门静脉、显露肝门静脉2～3 cm，与门静脉下置两条4号结扎线暂不结扎，穿刺针插入门静脉后立即结扎固定，尽快启动蠕动泵，同时剪断肝下腔静脉远端，用37℃预温20 min后的D-Hanks液20～30 mL/min快速经门静脉灌注清除肝内血液，30 s内即可见肝脏颜色变浅，持续灌注10 min至肝脏呈米黄色。当下腔静脉中流出的液体变清时，开始灌注经37℃预温20 min后的消化酶液100 mL(25 mgⅣ型胶原酶)，按照灌流速度为10～20 mL/ min充分消化肝脏10～20 min。直至肝脏表面出现龟裂状且变软。停止灌注，小心剪取各肝叶置入消毒平皿内，撕碎肝脏并去除纤维结缔组织，将制成的混合肝细胞悬液分别过100目、200目筛网后，低速离心3次(50×g，3 min)，获得纯化的肝细胞。

1．4 肝细胞的原代培养 采用DMEM F12培养液培养，将活力在90%以上的肝细胞以(2～5)×105/mL的密度接种于铺有鼠尾胶2 μg/mL的60 mm培养皿中，培养液中加入下列成分以利于肝细胞的生长，以青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L，胎牛血清20%。每皿中加入4 mL。培养条件为5%CO2的37℃孵箱，稳定培养24～36 h后换入新鲜培养液。

1．5 大鼠肝细胞成活率与形态学观察 新取肝细胞活细胞记数，取经3次洗涤后的肝细胞悬液加入等量台盼蓝染液混合染色数秒后，滴于玻片，置显微镜下行活细胞记数。

1．6 倒置显微镜下观察新分肝细胞形态

1．7 PAS染色鉴定肝细胞 待肝细胞生长成片后，取出盖片，依次进行0．9%的生理盐水清洗2次，每次约3 min，70%的酒精固定约10 min。PAS染色，封片，镜下观察。

2 结果

2．1 台盼蓝染色后细胞计数 每只体质量约200 g的大鼠能成功分离出(1．0～1．5)×108个肝细胞，低倍镜下可见活细胞呈光亮圆形，饱满，透光度好，胞核清晰，且不被台盼蓝着色，而死细胞壁皱缩，透光度差，可被台盼蓝染成蓝色。本法所取活细胞率可达90%以上。

2．2 细胞形态学观察 游离的活肝细胞呈分散状，胞体透亮、圆形、具有立体感。胞核较大，2～4 h后细胞开始贴壁。24 h后生长良好的肝细胞成岛屿状或多边形，集落生长融合成片铺满皿底。其中可见有多核的肝细胞，48 h后有大量肝细胞贴壁，呈板状，连接成岛屿(见图1、图2)。

2．3 PAS染色鉴定 100倍物镜下可见肝细胞胞质被染成粉红色，胞核不染色，400倍物镜下可见胞质中密集粉红色糖原颗粒，胞核呈空泡状(见图3)。

图1 新分肝细胞，圆形，未贴壁(200×);图2 48 h后肝细胞贴壁，呈板状，连接成岛屿(200×);图3 PAS染色后肝细胞，呈粉红色(200×)Fig 1 Primary hepatocytes，round，not adherent(200×);Fig 2 They were adherent，plate and formed small clusters of parenchymal cells(200×);Fig 3 Hepatocytes were identified by PAS．They were pink(200×)

3 讨论

肝脏作为机体不可缺少的重要代谢器官，一直备受关注。所以肝细胞的分离作为一种体外实验也越来越被重视。原位灌注消化法分离大鼠肝细胞由Berry等［5］于1969年报道，后经Seglen等［6］的改进，包括两个原位灌注的步骤。本实验对分离大鼠肝细胞的步骤进行了细致的摸索，并进行了一系列改进，分离出的成年大鼠肝细胞获得较高的存活率、纯度及产率，台盼蓝染色证实大鼠肝细胞成活率在90%以上。培养过程中肝细胞生长状态良好。通过摸索与实验我们发现，大鼠肝细胞的成功分离与以下因素密切相关:①用体质量为180～250 g的年轻SD大鼠分离较好。② 先用乙醚吸入式麻醉大鼠，但要在其未昏迷时腹腔注射水合氯醛。如乙醚吸入麻醉时间过久再注射麻药易造成麻醉过度从而影响肝细胞的成功分离。③门静脉穿刺时针头延门静脉的走向穿刺，且穿刺前检查针头处有无气泡，防止造成肝内空气栓塞从而影响灌冲肝的效果。其次进针过深或过浅均对肝脏的灌冲有影响。④消化酶的浓度一般以0．02%～0．03%为宜，浓度过高胶原酶会破坏肝细胞膜，而浓度过低则对肝脏消化不彻底，均会使分离下来的肝细胞成活率低。⑤有文献介绍撕肝后于胶原酶溶液中震荡15 min，此步骤经笔者实验后发现对肝细胞产量影响较大，考虑可能是震荡过程中胶原酶对肝细胞消化作用较强会使其变为细胞碎片，从而离心后得到的细胞产量较少。⑥本研究采用的低速离心(50×g，5 min×3次)可以将肝实质细胞与非实质细胞有效分离开，同时减少对肝细胞的损害。⑦虽然文献多介绍24 h换液，但为了避免换液时未贴壁的肝细胞损失过多，可于36 h再换，或换液时轻轻吸取表面少量培养液后，换入新鲜培养液，在保证提供细胞足够养分的同时不会丢失过多活细胞。⑧选择含有多种因子的培养液，且加入足够的血清及营养，在培养时间内，注意观察培养液的颜色，及时添加养料，保证实验期间肝细胞的稳定及较高的存活率［7-9］。⑨肝细胞生长条件要求较高，运用含营养物质丰富的培养液对肝细胞的生长及多边形态是有保证的［10］。通过比较应用，选用DMEM-F12培养液使肝细胞的贴壁及形态优于199或1640一类的基础培养液。

综上所述，众多学者在实际操作过程中不断总结经验，分离效果不断提高。本实验对传统肝细胞分离技术做些许改进后，步骤简单，成本低廉，分离出的肝细胞产率及成活率均较高，为肝细胞的体外研究奠定了基础。

［1］Liddle C，Coodwin BJ，Tapner M．Culture and tranfection of manmmlian primary hepatocytes and hepatocyte-de-rived cell lines［J］．J Gastroenterol Hepatol，1998，13(8):855-862．

［2］Eagle H．Amino acid metabolism in mammalian cell cultures［J］．Science，1959，130(4):432-437．

［3］Smedsr DB，Perteft H，Eggertsen G，et al．Functional and morphological characterization of cultures of Kupfer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Pecol，and selective substrate adherence［J］．Cell Tissue Res，1985，241(3):639-649．

［4］Ishii M，Vreman B，LaRusso NF．Isolation and morphological characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver［J］．Gastroenterology，1989，97(5):1236-1247．

［5］Berry MN，Friend DS．High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells［J］．J Cel Biol，1969，43(3):506-520．

［6］Seglen PO．Preparation of isolated rat liver cells［J］．Methods Cell Biol，1976，35(1):29-83．

［7］Vincent R，Nadeau D．Adjustment of the osmolality of pereol for the isopyenie separation of cels and cel organelles［J］．Analy Biochem，1984，141(2):322-328．

［8］Diener B，Utesch D，Beer N，et al．AmetIled for eryopreservation of liver parenehymal cells for studies of xenobiotics［J］．Cryobiology，1993，30(2):116-127．

［9］Page DT，Garvey JS．Isolation and characterization of hepatocytes and Kupfercels［J］．J Immunol Methods，1979，27(2):159-l73．

［10］Hong WQ，Sheng HZ．Separation and culture of adult rat hepatocytes［J］．Bulletin of the Academy of Military Medical Sciences，1993，17(1): 57．

洪文清，盛和章．成年大鼠肝细胞的分离及培养［J］．军事医学科学院院刊，1993，17(1):57．