陈 超，陈 宁，覃 霞，朱 樑

第二军医大学长征医院消化内科，上海200003

肝星状细胞(HSC)是肝纤维化发生发展的中心环节［1］。HSC可由静息状态活化为成纤维细胞，促进细胞外胶原的沉积，在肝纤维化及肝肿瘤的发生发展中到重要的作用;同时，可能作为一种具有多向分化潜能的祖细胞［2］，成为肝病研究中的一个焦点。因此，分离原代肝星状细胞是肝纤维化研究的重要基础工作之一。酶原位灌注消化法和密度梯度离心法两步法是分离HSC最为常用的分离方法［3-5］。HSC胞浆内含有两类VitA的“脂滴”:Ⅰ类“脂滴”靠近胞膜，直径约2 μm;Ⅱ类“脂滴”靠近胞核，直径约8 μm［6］。由于“脂滴”的存在，HSC在细胞密度上要小于肝细胞。因而，在进行密度梯度离心时，HSC产生一定的浮力，可以与其他肝内细胞分离开。但是，HSC分离难度大，成功率并不高。不少实验者即使在酶原位灌注消化效果较好的情况下仍然不能分离得到纯度和产量较高的HSC，因此百思不得其解。笔者经过近百次原代大鼠HSC分离实验，采取多重多次密度梯度离心法改良了肝星状细胞分离方法，有效避免HSC分离过程中由于操作误差及HSC本身特征所导致的细胞流失，最大程度减小了在酶原位灌注消化效果较好的情况下HSC得率和纯度仍较低的发生几率，HSC得率和纯度更加稳定，达到国外文献报道水平，为肝纤维化的研究奠定坚实基础。

1 材料与方法

1．1 实验动物 雄性SD大鼠，体质量400～500 g，购自第二军医大学动物实验中心。普通饲料喂养，自由进食及饮水。

1．2 主要试剂 链酶蛋白酶(Pronase E)，德国Merck公司产品;Ⅳ型胶原酶(Collagenase typeⅣ)，Gibco公司产品;DNA酶Ⅰ(DnaseⅠ)，Bio basic公司产品;Nycordenz，挪威Axis-Shield公司产品;DMEM、胎牛血清为美国Hyclone产品。

1．3 分离和培养用溶液

1．3．1 前灌注液:NaCl 8 g，KCl 0．4 g，KH2PO40．06 g，NaHCO30．35 g，酚红0．02 g，加超纯水至终体积1 000 mL，pH=7．4。

1．3．2 酶配制液:NaCl 8 g，KCl 0．4 g，CaCl20．56 g，Na2HPO4·12H2O 0．151 g，NaH2PO4·2H2O 0．078 g，HePes 2．38 g，NaHCO30．35 g，酚红0．006 g，加超纯水至终体积1 000 mL，pH=7．2。

1．3．3 含钙GBSS液:KCl 0．37 g，CaCl20．2251 g，MgCl2·6H2O 0．21 g，MgSO40．0342 g，KH2PO40．03 g，NaHCO32．27 g，NaH2PO40．1196 g，葡萄糖1．0 g，加超纯水至终体积1 000 mL，pH=7．3。

1．3．4 Pronase E灌注溶液:Pronase E 140～150 mg，酶配制液100 mL。

1．3．5 Collagenase typeⅣ灌注溶液:Collagenase typeⅣ30 mg，酶配制液100 mL。

1．3．6 DnaseⅠ溶液:DnaseⅠ 7 mg，酶配制液25 mL。

1．3．7 后分散液:Pronase E 10 mg，酶配制液80 mL。1．3．8 28．7%Nycordenz分离液:Nycordenz 28．7 g，含钙GBSS 100 mL。

1．4方法

1．4．1 改良的HSC分离方法(多重多次密度梯度离心法):乙醚吸入麻醉大鼠后以7%水合氯醛0．45 mL/ 100 g腹腔注射麻醉大鼠，背位固定大鼠，常规消毒铺巾;暴露门静脉、胃冠状静脉，门静脉下置两根4号丝线;结扎门静脉远端并行门静脉穿刺，置管并结扎;开启恒流泵，以15 mL/min灌注37℃浴热的D-Hank’s液，迅速用显微血管钳阻断胃冠状静脉，待肝脏稍变色，迅速剪开下腔静脉，直至肝脏变为土黄色;以8 mL/min依次灌注37℃浴热的Pronase E灌注溶液、Collagenase typeⅣ灌注溶液。分离并剪碎肝脏，倒入三角烧瓶内，加入后分散液约80 mL与DNaseⅠ液8 mL，37℃振荡消化25 min。取出消化液，经200目尼龙网滤过，将滤液在4℃中以760×g离心7 min。弃上清，DMEM培养液第二次清洗离心(760×g离心7 min);弃上清，4℃中以50×g离心3 min;弃细胞沉淀，上清4℃中以760×g离心7 min;弃上清，用28．7%的Nycodenz+DNaseⅠ液2 mL+DMEM 2 mL调成密度约1．040～1．050 g/mL细胞悬液装于15 mL无菌离心管内，小心上铺少许GBSS液;20℃下行零加减速度密度梯度离心(1 350×g离心18 min)。离心结束后取界面处细胞，用DMEM培养液离心清洗1次(760×g离心7 min)，在含20%FBS的DMEM中混匀并接种10 cm培养皿;取第一次密度梯度离心后的离心管，将细胞沉淀混匀后以760×g重新离心7 min，弃上清，用28．7%的Nycodenz+DNaseⅠ液2 mL+DMEM 2 mL调成密度约1．050～1．060 g/mL细胞悬液装于15 mL无菌离心管内再次密度梯度离心，离心结束后取界面处细胞清洗并接种于培养皿中。

1．4．2 HSC性质及纯度的鉴定:①台盼蓝染色方法鉴定细胞活性:0．4%台盼蓝溶液10 μL加入至90 μL细胞悬液中，混匀，光镜下未着色者为活细胞。②HSC性质鉴定:328 nm紫外光激发HSC自发荧光，鉴定HSC性质。③Desmin细胞免疫荧光方法鉴定及检测HSC纯度、α-SMA细胞免疫荧光方法检测HSC静息和活化状态:4℃预冷PBS缓冲液洗细胞爬片2 min×2次，4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS缓冲液洗5 min×2次;含0．03%Triton-X100的PBS室温孵育30 min，室温PBS缓冲液洗5 min×3次;3%羊(或兔)血清室温下孵育1 h封闭非特异性抗原;封闭液稀释的一抗(α-SMA，1∶100;Desmin，1∶50)4℃孵育过夜;室温PBS缓冲液洗5 min×3次，PBS稀释相对应的荧光二抗(1∶100)避光室温孵育20 min;室温PBS缓冲液洗5 min×3次，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察。

2 结果

2．1 细胞形态观察 刚分离的HSC为折光性很强的小圆细胞，形态均一，远小于肝细胞;体外培养2 d后HSC大多贴壁生长，形态呈椭圆形，光镜下可见脂肪颗粒;体外培养7 d后HSC脂滴消失，胞浆开始伸展，胞体变得细长;培养14 d后HSC胞浆完全伸展，内可见平行排列的细胞骨架(见图1)。

2．2 HSC得率、性质及纯度鉴定 本实验采取酶原位灌注消化法和多重多次密度梯度离心方法，每只正常SD大鼠HSC得率为(3～5)×107个，减少了在HSC密度梯度离心过程中因操作误差及HSC自身密度相对不均一性而造成的细胞流失，较单重单次密度梯度离心方法分离HSC产量及纯度更高、更稳定。台盼蓝拒染显示HSC活率95%以上，328 nm紫外光激发HSC自发蓝绿色荧光(见图2)，Desmin和α-SMA细胞免疫荧光方法显示静息HSC(体外培养2 d)胞浆内Desmin表达阳性，所有细胞核着蓝色，细胞纯度90%以上，静息HSC胞浆内α-SMA表达阴性;活化HSC(体外培养14 d)胞浆内Desmin表达阳性，活化HSC胞浆内α-SMA表达阳性，细胞纯度几乎100% (见图3、图4)。

3 讨论

肝星状细胞的分离是肝纤维化机制研究的关键，也是难点。在正常肝脏内，肝星状细胞占肝细胞总数的5%，分布在Disse间隙的血窦周边，长长的树突环绕于肝板之间的血窦中。肝星状细胞富含脂滴使其密度最轻，且易与肝细胞吸附。目前最常用的肝星状细胞分离方法多采用酶原位灌注消化法和密度梯度离心相结合的两步法:利用酶消化肝细胞、分散肝星状细胞，再以密度梯度离心、纯化HSC。肝星状细胞的分离有两大关键步骤:一是肝脏充分消化。肝脏充分消化的前提是肝脏在酶灌注前血液冲洗的干净与否。二是准确配制密度梯度分离液。然而，不少实验者在肝星状细胞分离过程中发现，有时在酶原位灌注消化极为理想的情况下，HSC分离的产量和纯度仍不理想，白白耗费了大量时间、精力及金钱，却仍百思不得其解。笔者根据近百次分离肝星状细胞的经验发现，原因很可能出在密度梯度分离液的配制上。目前国内文献多推荐密度梯度分离液的密度调为1．053 g/mL。然而，根据此密度进行分离HSC时有时却会发现HSC产量和纯度极低。究其原因，笔者认为有以下两点:其一，在密度梯度分离液实际配制过程中，微小的操作误差即能引起密度极大的变化。这在单次单重密度梯度离心尤为明显;其二，以1．053 g/mL密度梯度离心分离HSC后，仍有不少数量HSC存在于废弃的细胞沉淀中。笔者在数十次分离 HSC的实验中发现，在1．040～1．060 g/mL密度范围内进行多次多重密度梯度离心分离HSC将有效解决上述两种原因所导致的HSC产量和纯度低下的问题。在1．040～1．060 g/mL范围内配制多重密度离心，降低了单次操作的误差几率，在不影响HSC分离纯度的基础上，将HSC分离过程中因操作误差导致细胞丢失减小到最低程度。同时，相比单重密度(1．053 g/mL)梯度离心法，多重多次密度梯度离心能将细胞沉淀中尚存的HSC尽可能多地分离出来，大大提高HSC产量而未影响HSC纯度。单次单重密度(1．053 g/mL)梯度离心分离HSC后细胞沉淀中仍存在较多数量HSC，笔者认为可能有两方面原因:一是肝内HSC存在不同亚群，其密度虽接近但相对不均一。因此，在以单重单次密度梯度离心分离HSC时只有部分HSC能够被分离出来，而在一定范围内采取多次多重密度梯度离心则能得到更多HSC;二是HSC与死去的肝细胞粘连在一起，在单次单重密度离心时未被分离出来，而多次多重离心可能再次分散HSC对肝细胞的粘连而被分离出来。

综上，笔者建议采取酶原位灌注消化法和多重多次密度梯度离心结合的方法分离肝星状细胞提高细胞产量及纯度。密度配制以1．040～1．060 g/mL范围内为宜。另外，体外分离细胞时间不能过长，否则将影响细胞的活性，因此，笔者建议多重多次密度离心以2～3次离心密度梯度离心为宜。

［1］Gressner AM，Weiskirchen R．Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-β as major players and therapeutic targets［J］．J Cell Mol Med，2006，10(1):76-99．

［2］Kordes C，Sawitza I，Müller-Marbach A，et al．CD133+hepatic stellate cells are progenitor cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2007，352(2):410-417．

［3］ Friedman SL，Roll FJ．Isolation and culture of hepatic lipocytes，Kupffer cells，and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan［J］．Anal Biochem，1987，161(1): 207-218．

［4］ Ramm GA．Isolation and culture of rat hepatic stellate cells［J］．J Gastroenterol Hepatol，1998，13(8):846-851．

［5］Knook DL，Seffelaar AM，de Leeuw AM．Fat-storing cells of the rat liver．Their isolation and purification［J］．Exp Cell Res，1982，139 (2):468-471．

［6］Hendriks HF，Verhoofstad WA，Broower A，et al．Perisinusoidal fatstoring cells are the main vitamin A storage sites in rat liver［J］．Exp Cell Res，1985，160(1):138-149．