金长江，郑先哲

（东北农业大学工程学院，哈尔滨 150030）

黑加仑（Black currant.L），学名黑穗醋栗，是新兴的第三代小浆果，其果实营养价值和经济价值较高，其中维生素C、花青素、果糖、果酸含量较高，是影响黑加仑内部品质的重要因素。目前我国对小浆果品质的检测、分级仍然停留在人工水平上，检测速度慢[1-2]。

近红外光谱检测技术是随着化学计量学发展而开拓出来的一个新应用领域，目前大约有四十多个国家和地区开展近红外光谱检测技术的研究和应用[3]。近红外光谱检测的浆果对象主要有苹果、梨、桃子、柑桔类、草莓、李子、葡萄、香蕉和芒果等果树种类，光谱检测方式主要以漫反射和透射为主[4]，但很少有应用近红外光谱方法快速检测黑加仑营养成分的研究报道。本研究以黑加仑为研究对象，以维生素C、花青素、果糖、果酸四种营养成分含量为考察指标，采用近红外技术，探究一种简捷、快速、高效的检测方法。本研究对于小浆果优良品种的选育推广，改善生产、加工企业产品质量控制，提高市场竞争力，从而促进我国黑加仑产业的经济效益具有较大现实意义和理论价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验所用黑加仑由东北农业大学园艺实验站提供，选取代表性的样品50个，其中40个作为校正集样品，另外10个作为预测集样品，二者比例为4∶1。

酚酞、乙醇、氢氧化钠、草酸、抗坏血酸、2,6-二氯靛酚钠、碳酸氢钠、蒽酮、葡萄糖、浓硫酸均为分析纯，由天津市福辰化学试剂厂生产；儿茶素标准品（Catechin），纯度大于99%，由上海工硕生物技术有限公司提供。

1.2 试验仪器

试验所用主要设备为近红外台式谷物、食品、乳制品分析仪（ZX-888，由奥斯博国际有限公司生产，美国），测试方法为漫透射，扫描速度可达35次·s-1，配有透射检测器、采样系统以及ZX-888 Calibration Software近红外定量分析软件。本试验所用其他仪器:DK-98-IIA型数显恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；ARRW60型电子精密天平（上海奥豪斯公司）；DL-5低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；UV757CRT紫外-可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 近红外光谱采集[5]

将样品依次编号，用打浆机将样品打成浆状，再放入匀浆机中匀浆30 s，最后放入试样杯中，在ZX-888近红外台式谷物、食品、乳制品分析仪上进行光谱测定，样品池为光程为13 mm的石英试样杯，波长范围918～1045 nm，分辨率为8 cm-1，每个样品扫描3次，取平均值，所得光谱数据以文本的形式存入计算机内。

1.3.2 化学测定

与光谱测定时间相同，用化学方法测出每一个样品对应的总酸、维生素C、总糖和花青素含量。总酸测定采用NaOH滴定法（GB/T12456-90），以苹果酸计；维生素C测定采用2,6-二氯靛酚滴定法；总糖采用蒽酮比色法；花青素含量测定[6]:配制儿茶素标准溶液，浓度为1.2 mg·mL-1，分别取1、2、3、4、5mL，定容至10mL。再各取1mL，分别加入5mL显色剂。在500nm波长下，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，花青素浓度为横坐标绘制标准曲线，取1～2 g黑加仑果浆，加入10mL甲醇，震荡 20 min，3000 r·min-1离心 20 min，取上清液1mL，显色分析，由标准曲线可算出样品中原花青素含量。

1.4 化学计量学方法的选择[7-12]

采用多元线性回归（MLR）、主成分回归分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）三种方法通过校正集样品光谱和测得的化学值建立校正模型，然后用预测集样品对模型进行验证，考察其预测结果与化学值的一致性。

1.5 数据处理

用ZX-888 Calibration Software近红外定量分析软件和基于matlab7.0软件的自编程序对试验数据进行处理，采用多元线性回归（MLR）、主成分回归分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）三种统计方法对校正集样品中总酸、维生素C、总糖、花青素含量与近红外光谱吸收值之间进行回归，选择最佳校正数学模型。评价校正模型的预测性能和可靠性由决定系数（R2）、校正标准偏差（RMSEC）、预测标准偏差（RMSEP）来进行[4]。

式中，n校正集样本数；yi为第i个样品的预测值；yi为第i个样品的化学值（真值）；ym为样本真值的平均值；P为回归因子数目，试验中选P为12；N为预测集样本数；yNi为第Ni个样品的预测值；yNi为第Ni个样品的化学值（真实值）。

2 结果与分析

2.1 花青素含量标准曲线

花青素标准曲线如图1所示。

回归方程为:y=1.609x+0.006；相关系数为:R2=0.9929。由图1可知，吸光度A与花青素浓度有良好的线性关系，可用作测定黑加仑中花青素含量。

图1 花青素的标准曲线Fig.1 Standard curve of anthocyanin

2.2 校正集和预测集样品的分布特征

校正集和预测集样品的分布特征如表1所示。

2.3 黑加仑果浆近红外漫透射光谱分析

不同营养成分黑加仑果浆近红外漫透射光谱如彩版Ⅰ所示。

本试验对每个样品采集12个波长点处的吸光度值，波长点分别为918、928、940、950、968、975、985、998、1010、1023、1037 和 1045 nm，波长间隔在10nm左右。彩版Ⅰ所绘光谱图是40个校正集样品在这12个波长点处吸光度值的折线图。从彩版Ⅰ中可知，虽然40个样品营养成分含量明显不同，但它们的大部分图谱却十分相似。光谱图中，图谱在零线左右基本呈对称分布，在975 nm附近出现1个较强的吸收，建模所需的光谱信息较易被识别。从基团的近红外吸收角度分析[4-5]，1666～2500nm主要为水分子羟基组合频峰，740～1080nm主要为C-H、O-H基团的三级和四级倍频峰，而黑加仑中的有机酸、糖类、维生素C、花青素含有大量的以上基团以及酚类和醇类羟基，故918～1045 nm波段范围基本能够覆盖所研究营养成分的近红外光谱信息，并能排除水的干扰。

表1 校正集和预测集样品的分布特征Table1 Calibration sets and prediction set sample distribution

2.4 不同数学处理方法的比较

表2是校正集样品近红外漫透射光谱吸光度及营养成分含量化学值数据，表4是预测集样品近红外漫透射光谱吸光度及营养成分含量化学值数据。其中 x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10、x11、 x12分 别 为 样 品 在 波 长 点 918、 928、 940、950、968、975、985、998、1010、1023、1037和1045 nm处的光谱吸收值，y1、y2、y3、y4表示样品的总酸含量化学测定值（%）、维生素C含量化学测定值（mg·100 g-1）、总糖含量化学测定值（%）、花青素含量化学测定值（mg·100 g-1）。

分别用近红外定量分析软件（ZX-888 Calibration Software）对以上数据进行多元线性回归、用matlab程序对以上数据进行主成分回归分析、偏最小二乘回归，得到40份校正集浆液样品中总酸、维生素C、总糖、花青素含量与近红外光谱吸收值之间的预测方程（程序见附录），预测方程的评价结果见表5。R2越大，RMSEC、RMSEP越小说明模型准确性越好。

由表4可知，总酸模型MLR、PCA算法的决定系数（R2）分别为0.9097、0.8691，校正标准偏差（RMSEC）分别为0.3324、0.4003，预测标准偏差（RMSEP）分别为0.1129、0.4998，可见两个总酸模型的R2都大于0.8，RMSEC、RMSEP都较小，均符合模型应用要求；而总酸模型的PLS算法的决定系数只有0.2088，严重偏小，且RMSEC、RMSEP都较大，分别为0.9840、0.6405，因此PLS算法不适合对总酸建模，其原因主要是自变量间多重线性关系不明显。维生素C模型MLR算法的决定系数（R2）为0.8826，校正标准偏差（RMSEC）、预测标准偏差（RMSEP）分别为13.4896、2.5210，可以作为预测维生素C含量的校正模型；而维生素C模型的PCA、PLS算法的决定系数（R2）分别为 0.7429、0.5694，小于0.8，且RMSEC较大，分别为19.9647、25.8376，RMSEP也较大，分别为14.5588、14.5541，不可选。总糖模型MLR、PCA算法的决定系数（R2）分别为0.9662、0.8156，校正标准偏差（RMSEC）分别为0.1923、0.7839，预测标准偏差（RMSEP）分别为0.1307、0.8787，两个总糖模型的R2都大于0.8，但RMSEC、RMSEP前者较小，后者较大，因此前者较符合模型应用要求；而总糖模型的PLS算法的决定系数为0.6740，偏小，且RMSEC、RMSEP都较大，分别为1.0422、0.6147，因此PLS算法不适合对总糖建模。花青素模型MLR、PCA、PLS算法的决定系数（R2）分别为0.9488、0.9804、0.8027，校正标准偏差（RMSEC）分别为22.8507、14.1208、44.8465，预测标准偏差（RMSEP）分别为39.5303、8.4196、29.3958，可见三个花青素模型的R2都符合要求，但只有PCA算法RMSEC、RMSEP较小，符合模型应用要求，而花青素模型的MLR、PLS算法的RMSEC、RMSEP都太大，不适合对花青素建模。

表2 校正集样品近红外漫透射光谱吸光值及营养成分含量化学值数据（部分数据）Table2 Calibration-set samples NIR spectral absorbency and nutritional content value data

表4 不同回归方法得到预测方程的评价结果Table4 Different return method obtains forecast equation measure results

综合上述分析，用多元线性回归建立的总酸、维生素C、总糖含量的数学模型最好，用主成分回归分析建立的花青素含量的数学模型最好。

2.5 预测方程拟合质量的检验

经2.2讨论得到的最优预测方程为（1）～（4）:

将预测集样本在各波长点处的吸光值代入以上相应的预测方程可得到每个样本的预测值，结果如图2～5，各图表示了预测集样品预测值与真值的相关系数和残差。

图2 总酸预测值与真值的关系Fig.2 Total acid predicted values and the true value of the relationship

图3 VC预测值与真值的关系Fig.3 VC predicted value and true value relational

由图2～5可知，从分布上看，四个数学模型的残差分布比较均匀，10个预测样品总酸、维生素C、总糖和花青素的残差之和分别为-0.39、6.75、-0.43、3.75，相对误差接近0；总酸、维生素C、总糖和花青素的预测相关系数分别为0.9892、0.9912、0.9963、0.9829，相关性较高，可以满足实际要求。

图4 总糖预测值与真值的关系Fig.4 Total sugar predicted values and the true value of the relationship

图5 花青素预测值与真值的关系Fig.5 Anthocyanin predicted values and the true value of the relationship

3 讨论

在近红外区，主要是含氢基团如C-H、O-H、N-H等基团的分子振动的倍频、合频。由于吸收较弱，分子的倍频、合频的组合方式复杂多样，谱带宽，没有锐峰，大量的是重叠谱峰，特别是黑加仑中的有机酸、糖类、维生素C、花青素都含有大量的C-H、O-H基团，常常出现重叠的谱图，也就是说每一波长点的吸光值都有可能是这四种有机物吸收的共同结果，因而很难精确归属近红外光谱带。对这些复杂有机物的光谱分析，需要利用其在全波长的信息（918～1045 nm），运用化学计量学方法进行研究。由于不同基团产生的光谱在吸收峰位、强度上不同，随着样品组成的变化其光谱特征也将发生变化，根据测定黑加仑样品的近红外光谱与它们的组成数据，通过合理的光谱处理及校正方法，可以建立样品光谱与组成间的校正模型。

从模型优化的数据可知，选择不同的回归方法对模型检验的R2值、RMSEC值、RMSEP值存在很大差异，对于黑加仑果浆样品，选择合适的波长和数学处理方法，才能得到高质量的黑加仑营养成分测定的预测模型。通过对多元线性回归（MLR）、主成分回归分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）三种建模方法对比分析得出:用多元线性回归建立的数学模型更适合预测总酸、维生素C、总糖的含量，用主成分回归分析建立的数学模型更适合预测花青素的含量。

4 结论

从残差和预测相关系数分析可得出:经优化的4个数学模型预测效果较好，该方法对同时快速定量分析黑加仑多组分含量是可行的，可以在实践中应用和推广。

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