齐玉明 石彬 郭皓 成艳梅

胞质HuR在卵巢上皮性癌的表达及意义

齐玉明 石彬 郭皓 成艳梅

目的检测HuR在卵巢上皮性癌中的表达及与临床病理参数的关系，寻求卵巢癌的预后因素。方法 采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法和逆转录RT-PCR技术，检测胞质和胞核HuR在正常、交界性、恶性卵巢组织中的表达;分析胞质HuR的表达与预后的关系。结果 胞质和胞核HuR在恶性卵巢肿瘤组织的表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，胞质和胞核HuR在交界性卵巢肿瘤的表达与正常卵巢组织比较无显着性差异;胞质HuR的表达随组织学分级、临床分期增高，阳性表达率逐渐增高，胞核HuR的表达与临床病理参数无关。结论 HuR的过表达可能在卵巢癌的发生发展中起重要作用，检测胞质HuR在卵巢癌中的表达可预测该肿瘤生物学行为特征，可作为独立的预后指标。

卵巢上皮性癌;胞质;胚胎致死异常视觉A;预后

HuR是RNA结合蛋白中胚胎致死异常视觉(ELAV)家族的一员，ELAV家族是最紧密的RNA结合蛋白。HuR广泛存在于几乎所有的增殖细胞中，通过一定的信号途径参与细胞的增殖、分化等多种细胞行为的调节。人体内有多种细胞可分泌HuR，但在一些正常组织中表达水平很低，而在许多恶性肿瘤中表达水平增高，且与预后不良有关。本研究旨在检测HuR在卵巢上皮性癌的表达，并分析胞质HuR表达与临床病理参数的关系，为临床治疗提供新的途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2001年6月至2008年8月，在河北医科大学第二临床学院妇科因卵巢上皮性癌而接受手术治疗的患者68例，平均年龄52岁。术前均未接受放疗、化疗、激素及免疫治疗，术后病理组织学诊断明确。按照WHO(1973)标准将研究对象进行组织学分类及分级，其中包括浆液性囊腺癌44例，黏液性囊腺癌18例，子宫内膜癌6例;病理分级:高分化10例，中分化30例，低分化28例;有淋巴结转移者30例，无淋巴结转移者38例;按照2000年FIGO临床分期标准，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期31例，Ⅳ期10例;选择同期交界性卵巢肿瘤10例(浆液性6例和黏液性4例)和同期因其他原因行子宫+双附件切除的正常卵巢5例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集:肿瘤切下后，从肿瘤生长活跃、无坏死的边缘部位取下约1 cm3大小的组织2块，一块放入甲醛溶液固定、石蜡包埋，用于免疫组化测定;另一块装入酶灭活的冻存管，迅速投入液氮中，然后转入-80℃冰箱保存待测。

1.2.2 免疫组化法检测卵巢上皮性癌组织、交界性卵巢肿瘤组织、正常卵巢组织中HuR的表达:标本常规脱水、包埋并制成4 μm厚的连续切片，采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法，进行组化检测。兔抗人多克隆HuR抗体为Santa Cruz产品，兔SP免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购于北京中杉金桥试剂公司。染色步骤按SP试剂盒(北京中杉金桥试剂公司)说明书进行，一抗滴度为1∶200。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。

1.2.3 RT-PCR技术检测卵巢上皮性癌和正常卵巢组织中HuR mRNA的表达:引物及试剂盒由北京赛百盛基因有限公司提供。采用 TRIzol一步法提取组织总 RNA。反应总体积20 μl，RNA 模板量1 μg，参照试剂盒说明进行。产物长度及引物序列如下:HuR片段长度为 220 bp，上游引物:5’CGCAGAGATTCAGGTTCTCC-3’，下游:5’CCAAACCCTTTGCACTTGTT-3’;β-actin 片段长度为 540 bp，上游引物:5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物:5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。PCR反应条件:94℃预变性3 min、94℃变性 40 s、58℃退火 40 s、72℃延伸 40 s，33 次循环后 72℃延伸5 min。取5μl PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，β-actin作为内参照物，紫外透射成像系统显像，测定特异条带的密度并与内参照比较，得出目的基因mRNA的相对表达量。

1.3 统计学分析 应用SPSS 11.5统计软件，计数资料采用χ2检验，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胞核HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢肿瘤和正常卵巢中的表达 胞核HuR在卵巢癌、交界性肿瘤及正常卵巢中的阳性表达率分别为76.47%(52/68)、30.00%和0。卵巢癌中胞核HuR的表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢(P＜0.05)。见表 1，图1。

表1 HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织胞核中的表达 例(%)

图1 胞核HuR在子宫内膜样卵巢癌的阳性表达(SP×400)

2.2 胞质HuR在卵巢癌、交界性肿瘤和正常卵巢中的表达胞质HuR在卵巢癌、交界性肿瘤及正常卵巢中的阳性表达率分别为45.60%(31/68)、10.00%和0。卵巢癌中胞质HuR的表达明显高于交界性卵巢肿瘤和正常卵巢(P＜0.05)。见表2，图 2。)

表2 胞质HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的表达 例(%)

图2 胞质HuR在浆液性卵巢癌的阳性表达(SP×400

2.3 正常卵巢与卵巢上皮性癌组织HuRmRNA的表达 68例卵巢癌中54例为阳性表达(79.41%)，5例正常卵巢中1例为阳性表达(20.00%)，卵巢上皮性癌和正常卵巢组织中HuR mRNA表达水平分别为0.381±0.034和0.114，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表3，图3。

表3 正常卵巢与卵巢上皮性癌组织HuRmRNA的表达±s

表3 正常卵巢与卵巢上皮性癌组织HuRmRNA的表达±s

类别 HuRmRNA光密度值 P值正常卵巢组织(n=5)0.112±0.011 ＜0.01卵巢癌(n=68)0.381±0.034

图3 正常卵巢与卵巢上性癌组织HuRmRNA的表达

2.4 胞质HuR的表达与卵巢上皮性癌临床病理学特征的关系 胞质HuR与卵巢癌临床分期和组织学分级有相关性，而与发病年龄、组织学类型和淋巴结转移无相关性。临床分期Ⅲ～Ⅳ期胞质HuR的阳性表达率(56.09%)显着高于Ⅰ～Ⅱ期(29.63%)，差异有统计学意义(P＜0.05)。在组织学分级1级(高分化)、2级(中分化)、3级(低分化)胞质HuR的阳性表达率分别为10.00%、46.67%、57.14%，差异有统计学意义(P＜0.05)，胞质HuR的表达在中、低分化之间差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表4。

表4 胞质HuR的表达与卵巢上皮性癌临床病理学特征的关系

3 讨论

3.1 HuR在卵巢上皮性癌中表达的意义 HuR是ELAV家庭的一员，又称为类胚胎致死异常视觉蛋白A。ELAV家庭是最紧密的RNA结合蛋白，最初是在果蝇中被发现。ELAV家庭共包括四个成员:HuD、HuC、Hel-N1(HuB)和 HuR。HuR几乎在所有增殖的细胞中表达，而其他三个成员主要表达在终端分化的神经组织中。1996年，Ma等［1］利用PCR技术首先识别并克隆了HuR基因。许多早期反应基因的mRNAs在其3'非翻译区(untranslated regins，UTR)有 AU富含元件(AU-rich elements，AREs)，可以与顺式反应元件一起调节mRNAs的不稳定性。HuR分子量为36 kD，HuR即可与AREs相互作用，并且在转染哺乳动物细胞后稳定包含AREs的mRNAs并使之过表达，导致HuR表达增强。在人类许多恶性肿瘤，如乳腺癌［2］、结肠癌［3］、胃癌［4］、肺癌等中HuR的阳性表达率明显增高，表明HuR在恶性肿瘤的发生、发展中有一定作用［5］。本实验显示，HuR在卵巢上皮性癌中的表达明显高于交界性肿瘤和正常卵巢。为进一步证实HuR在恶性肿瘤中的表达，本实验又从mRNA水平检测HuR的表达率。结果显示:HuRmRNA在卵巢癌的表达率显著高于正常卵巢。表明，HuR的异常表达与卵巢癌的发生、发展有密切关系。HuR作为一种RNA结合蛋白，一方面可与许多基因的mRNA结合，从而调节细胞生长、分化、血管发生、蛋白表达调控等，导致肿瘤的发生。另一方面，HuR还可与许多基因相结合，如环氧合酶 2［6］、血管内皮生长因子(VEGF)［7］、炎性因子 IL-8、6 和肿瘤坏死因子(TNF)［8］、细胞周期调节蛋白 cyclinA和 cyclinB1、蛋白激酶 C的底物MARCKS，原癌基因 c-fos，uPA 和 uPA 受体等［9］，这类基因与恶性肿瘤的发生、发展和浸润密切相关。推测，HuR的表达上调可能是这些基因表达上调的原因之一，从而引起恶性肿瘤的发生。

3.2 HuR在胞质和胞核的表达及与临床指标的关系 近来研究表明HuR可以在核质间穿梭［10］，HuR即可在胞核表达，也可在胞质表达。Hu蛋白含有3个保守的RNA识别模序(RNA recognition motifs，RRMs)，在RRM2和RRM3之间有铰链区，该区内含一段包含52个氨基酸的HuR核质穿梭(HuR nucleocytoplasmic shuttling，HNS)区，对细胞定位和功能相当重要。可先与包含ARE的mRNAs在细胞核内结合，然后与之一起进入细胞质，保护mRNAs避免其衰变降解，从而导致HuR在多种恶性肿瘤中表达上调。Gallouzi等［11］研究表明HuR可以通过2种不同途径进入细胞质。一种是需要4种蛋白配体的依赖染色体区域维持蛋白质(CRM1)，另一种是非依赖CRM1而需要HNS，正是通过上述两种机制，使HuR在核与质间穿梭，从而使HuR在胞核与胞质均有表达。但是，许多结果显示胞质HuR的表达与临床病理参数和预后有关，而胞核HuR的表达与临床病理参数和预后无关［12］。本研究选择了与卵巢癌关系最密切的五个临床参数，结果显示，胞质HuR在卵巢癌中的表达，随着组织学分级的增加与分期的增加，表达率明显增加。未发现胞核HuR的表达与临床病理参数存在相关性。提示恶性程度越高，临床分期越晚，卵巢癌组织中胞质HuR的表达越强，患者的预后越差。胞质HuR的表达可能是影响癌症患者预后的因素之一［13］。但是对于其胞质分布的机理，有待进一步的研究。

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7 Cherradi N，Lejczak C，Desroches-Castan A，et al.Antagonisticfunctions of tetradecanoyl phorbol acetate-inducible sequence 11band HuR in the hormonal regulation of vascular endothelial growth factor messenger ribonucleic acid stability by adrencorticotropin.Mol Endocrinol，2006，20:916-930.

8 Ulus Atasoy，Stephanie L，Curry Isabel，et al.Regulation of Eotaxin Gene expression by TNF-α and IL-4 through mRNA stabilization:involvement of the RNA-binding protein HuR.J Immunol，2003，171:4369-4378.

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10 Fan XC，Steitz JA.Overexpression of HuR，a nuclear-cytoplas-mic shuttling protein，increases the in vivo stability of ARE-containing mRNA.EMBO J，1998，17:3448.

11 Gallouzi IE，Brennan CM，Steitz JA.Protein ligands mediate the CRM1-dependent export of HuR in response to heat shock.J RNA，2003，9:1410.

12 Heinonen M，Bono P，Narko K，et al.Cytoplasmic HuR expression is a prognostic factor in invasive ductal breast carcinoma.Cancer Res，2005，65:2157-2161.

13 Brosens LA，Keller JJ，Pohjola L，et al.Increased expression of cytoplasmic HuR in familial adenomatous polyposis.Cancer Biol Ther，2008，7:424-427.

The expression and significance of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma

QI Yuming*，SHI Bin，GUO Hao，et al．The Second Department of Gynecology，Handan Central Hospital，Hebei，Handan 056000，China

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of HuR in epithelial ovarian cancer and clinicopathological parameters in order to explore the factors that affect the prognosis of patients with epithelial ovarian carcinoma.MethodsThe expressions of cytoplasmic and nuclear HuR in normal ovary tissues，borderline tissue of ovary tumor and epithelial ovarian carcinoma were detected by SP immunohistochemical technique and RT-PCR.The relationship between cytoplasmic HuR expression and prognostic factors was analyzed.ResultsThe expressions of cytoplasmic and nuclear HuR in epithelial ovarian cancer tissue were significantly higher than those in borderline tissue of epithelial ovarian tumor and normal ovarian tissues，however，there was no significant difference between the borderline tissue of epithelial ovarian tumor and normal ovarian tissue(P＞0.05).The statistical analysis showed that the positive expression rate of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma was closely correlated with histological grade and FIGO stage，but the positive expression rate of nuclear HuR was not correlated with the clinicopathological parameters.ConclusionThe over-expression of HuR may play an important role in the growth and progress of epithelial ovarian carcinoma.To detect the expression of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma may predict the characteristics of oncobiology behaviour.The expression of cytoplasmic HuR may act as an independent prognostic indicator.

epithelial ovarian carcinoma;cytoplasmic;HuR;prognosis

R 737.31

A

1002-7386(2011)09-1296-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．005

056000 河北省邯郸市中心医院妇二科(齐玉明);河北医科大学第二医院妇科(石彬);河北省邯郸市中心医院ICU(郭皓)，妇二科(成艳梅)

石彬，050051 河北医科大学第二医院妇科;E-mail:cysboy@sina.com

2010-10-11)

·论著·