周巧梅，胡 刚，丁建花，曾因明

(1.广州军区广州总医院麻醉科，广东广州 510010;2.南京医科大学神经药理实验室，江苏南京 210029;3.徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室，江苏徐州 221002)

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一类广泛存在于真核生物细胞膜上、选择性高效转运水分子的特异孔道，对机体水液平衡和细胞微环境的稳定发挥重要调节作用［1］。其中，星形胶质细胞及广泛表达其上的AQP4还通过影响神经递质的释放，参与调节中枢神经传导［2］。本研究旨在通过对AQP4基因敲除小鼠的整体行为学和神经化学方面的研究，探讨AQP4与全麻药物作用的相关性。

1 材料及方法

1.1 动物、主要仪器和试剂成年同月龄♂ AQP4－/－小鼠(KO)及CD1小鼠(WT)，体质量25～30 g，由南京医科大学神经药理实验室提供。小鼠脑立体定位仪为美国Stoelting公司产品。微透析泵、微透析注射器和收集器等成套设备均为美国BAS公司产品。高效液相及荧光检测设备为日本岛津公司产品。OPA购自美国Fluka公司。丙泊酚购自北京费森尤斯卡比(批号UL158，分装批号070113)。

1.2 行为学实验WT/KO小鼠各10只。丙泊酚200 mg·kg－1［3］腹腔注射。盲法评价小鼠翻正反射［4］:给药至翻正反射消失记为潜伏期(TTLORR);翻正反射恢复记为持续期(DOLORR)。

1.3 微透析方法小鼠用0.2 mol·L－1水合氯醛麻醉后固定在脑立体定位仪上，根据小鼠脑立体定位图谱［5］将微透析探头埋置在右侧前额皮层，牙托粉固定，一周后开始实验。实验前14 h用透析液以2 μl·min－1灌流1 h。正式实验开始用透析液灌流平衡60 min后取样，每20 min收集1次样品共5次，将后3次样品的平均值作为麻醉前基础值，然后腹腔注射丙泊酚200 mg·kg－1，2 min后开始连续收集样品至给药后200 min。

1.4 高效液相色谱法应用HPLC与荧光检测仪联用的方法测定样品中的GABA含量。荧光检测器激发波长为338 nm，发射波长为 425 nm，流动相［6］流速 0.9 ml·min－1。将微透析样品与衍生液按2∶1混合，常温下静置1.5 min后进样，等度分离。

1.5 统计学处理采用SPSS 12.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 行为学实验给药后KO小鼠翻正反射消失的持续期时间明显短于WT小鼠(P＜0.01)。见Tab 1。

Tab 1 The time to LORR and the duration of LORR for propofol-induced in WT/KO mice

2.2 微透析及HPLC检测

2.2.1 基础状态 在基础状态下，WT/KO小鼠前额皮质GABA浓度分别为(0.009±0.004)μmol·L－1及(0.009±0.007)μmol·L－1，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2.2 给予丙泊酚后GABA浓度变化

2.2.2.1 给药后 WT小鼠 GABA浓度为(0.027±0.014)μmol·L－1，KO 小鼠 GABA 浓度为(0.043 ±0.014)μmol·L－1，两组间存在差异(P＜0.05)，且均较各自基础状态时增加(P＜0.01)。

2.2.2.2 WT小鼠 GABA 增加持续时间为(63.33±15.06)min，KO小鼠GABA增加持续时间为(28.01±10.95)min，KO小鼠GABA增加持续时间明显短于WT小鼠(P＜0.05)。

2.2.2.3 两组小鼠脑内GABA增加持续时间与各自DOLORR时间具有线性相关(r2=0.8372，P＜0.01)。

3 讨论

本研究首先通过行为学实验证实了AQP4基因缺失导致丙泊酚的催眠效应发生变化，提示AQP4在丙泊酚作用维持中可能具有重要作用。进一步通过相关脑区神经递质测定，论证了丙泊酚诱导神经递质释放与其催眠效应之间的相关性，而AQP4基因参与调节该作用。从而在整体上证实了AQP4参与调节神经递质释放和中枢神经传导，进而影响全麻药物效应的发挥，丰富了全麻原理研究。

丙泊酚是具有代表性的临床常用静脉全麻药，通常认为其主要作用于突触后GABAA受体、通过增加抑制性突触后电位而发挥麻醉效应。前额皮质是与催眠效应密切相关的目标脑区。本研究结果与既往报道的小鼠翻正反射消失伴随脑内GABA能神经传递增加结果一致［7］。提示GABA能神经传递与丙泊酚催眠效应密切相关。而行为学研究中观察到的AQP4基因缺失致丙泊酚催眠效应改变的现象可能系AQP4基因参与调节脑内GABA释放所致。

综上所述，本实验佐证了AQP4参与神经递质释放，调节中枢传导的观点，同时发现其功能正常在全麻药物效应发挥中的重要性，提示全麻原理不仅跟神经元突触有关，星形胶质细胞及其上表达的多种蛋白都可能在全麻药物效应发挥中具有一定作用。

［1］ Verkman A S.More than just water channels:unexpected cellular roles of aquaporins［J］.J Cell Sci，2005，118:3225 －32.

［2］ Verkman A S，Binder D K，Bloch O，et al.Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2006，1758(8):1085 －93.

［3］ Irifune M，Takarada T，Shimizu Y，et al.Propofol-induced anesthesia in mice is mediated by gamma-aminobutyric acid-A and excitatory amino acid receptors［J］.Anesth Analg，2003，97(2):424 －9.

［4］ Kubo K，Nishikawa K，Hardy-Yamada M，et al.Altered responses to propofol，but not ketamine，in mice deficient in the 65-kilodalton isoform of glutamate decarboxylase［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，329(2):592 －9.

［5］ Franklin K B J，Paxinos G.The mouse brain in stereotaxic coordinates［M］.Orlando:Acad Press，1997:1 －208.

［6］ Rea K，Cremers T I，Westerink B H.HPLC conditions are critical for the detection of GABA by microdialysis［J］.J Neurochem，2005，94(3):672 －9.

［7］ Katayama S，Irifunê M，Kikuchi N，et al.Increased γ-aminobutyric acid levels in mouse brain induce loss of righting reflex，but not immobility，in response to noxious stimulation［J］.Anesth Analg，2007，104(6):1422 －9.