王小翠，杨 洋，陈 刚，邓礼娟，徐晓玉

(1.西南大学药学院，重庆市药效评价工程技术研究中心，重庆 400716;2.重庆工商大学药物化学与化学生物学研究中心，重庆 400067)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是育龄妇女最常见的疾病，在一般人群中的发病率为10%～15%［1］。目前主要的治疗方式是采用手术移除异位病灶和雌激素治疗，但通常会有副作用大且易复发的缺点。近年来研究发现［1］，血管生成在EMS疾病中发挥着重要的作用，因此抗血管生成治疗已成为治疗EMS的新的途径。加味佛手散为本实验室创制的抗EMS的中药新药，由中医妇科著名方剂佛手散主要成份川芎嗪、阿魏酸加延胡索乙素组成，其处方与制备工艺已经申报国家技术发明专利。本文报道了主要药效学研究中，加味佛手散对EMS血管生成及其相关机制的一部分内容。目前对于川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素3个中药单体以及配伍合用对大鼠EMS模型的作用，国内外尚未见报道。因此，本研究通过建立大鼠EMS模型，从抑制血管生成角度来研究中药新药加味佛手散治疗EMS的机制，探讨加味佛手散对血管生成促进因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)以及血管生成抑制因子内皮抑素(endostatin)蛋白表达的影响，为临床应用加味佛手散治疗EMS提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD大鼠70只，♀，体质量180～220 g，清洁级，重庆医科大学实验动物中心供应［实验动物生产许可证号:SCXK(渝)2007－0001］，于西南大学药学院SPF级实验动物中心饲养［实验动物使用许可证号:SYXK(渝)2009－0002］。

1.2 药品和试剂加味佛手散由西南大学中药研究所研制提供，主要成分为川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素(原料药购自南京泽朗医药科技有限公司，批号分别为 QZ-0802010、QZ-0801010、QZ-071224)，孕三烯酮胶囊(北京紫竹药业有限公司，批号53080103)。兔抗大鼠 VEGF抗体、兔抗大鼠 endostatin抗体、小鼠抗大鼠β-actin抗体、兔抗大鼠Ⅷ因子抗体(Santa Cruz公司);免疫组化SP试剂盒、DAB试剂盒、辣根酶标记山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);PVDF膜、ECL试剂盒(Millipore公司);前列腺素 E2(PGE2)放射免疫分析试剂盒(北京华英生物技术研究所，批号HY－043);其余试剂为进口分装或市售分析纯。

1.3 方法

1.3.1 大鼠子宫内膜异位症模型的制备［2－3］以大鼠阴道脱落细胞涂片检测大鼠性激素周期，在大鼠动情期以水合氯醛麻醉，常规消毒，开腹，结扎右侧子宫两端后，从远端剪取长约1.5 cm的子宫段，剔除脂肪组织，剪成5 mm×5 mm的子宫组织3块，一块送病理检验，另外两块缝于腹壁，以黏膜面朝向腹膜，浆膜面朝向腹腔，关腹。术后腹腔注射庆大霉素，正常清洁饲养。建模4周后，择动情期第2次开腹观察移植物生长情况，并用游标卡尺测量移植物大小，以同时符合以下3条标准者为成功模型:①移植物体积增大，被结缔组织或大网膜覆盖并有血管形成，呈隆起透亮的小囊状，出现液体积聚，且积液高度=2 mm;② 游标卡尺测量移植物的体积大小，异位组织体积=0.52×长×宽×高［4］，移植物体积=8 mm3;③切取移植物送检，证实移植物中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质的生长。

1.3.2 动物分组 成功建模大鼠随机分为模型对照组、孕三烯酮0.5 mg·kg－1·d－1以及加味佛手散0.045、0.09、0.18 g·kg－1·d－1。各组灌胃给药，每天1次，连续4周，正常对照组和模型对照组同时灌胃给予相同容积的0.5%羧甲基纤维素钠混悬液。给药4周后，再次检查大鼠的性周期，择动情期手术，分离出腹腔侧移植物，通过游标卡尺测量移植物大小，液氮冻存。

1.3.3 免疫组化染色 取异位内膜组织常规包埋，用冰冻切片机5 μm连续切片，4%多聚甲醛固定，抗Ⅷ因子抗体、抗VEGF抗体或抗endostatin抗体为Ⅰ抗，阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)代替Ⅰ抗，按照SP试剂盒说明书进行免疫组化染色，用BI2000数字图像分析系统软件进行分析。异位组织MVD，VEGF和endostatin表达计算方法:先在低倍镜下(×100)进行全面观察，选取背景对比良好，染色均匀的视野，然后在高倍镜(×400)下进行观察，记录8个视野的阳性细胞表达个数。

1.3.4 Western blot检测 正常组取原位内膜，模型组、加味佛手散各剂量组和孕三烯酮组各取异位内膜组织约30 mg，在液氮中捣碎成粉末，加入0.5 ml冰预冷的RIPA裂解液和5 mg·L－1Aprotinin和5 mg·L－1Leupeptin的蛋白酶抑制剂，反复匀浆至组织溶解，加入PMSF至终浓度100 mg·L－1，冰上裂解 30 min，1.2 × 104r·min－1离心 30 min，取上清。Bradford法检测蛋白浓度。加入5×上样缓冲液于沸水浴中加热5 min，取等量蛋白进行 SDSPAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后，加入VEGF，endostatin和内参β-actin抗体4℃孵育过夜。TBST洗涤3次，再加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃与膜孵育1 h，TBST洗膜后，加入ECL试剂，显影，定影，分析条带光密度值，以目的条带与β-actin条带的光密度值的比值作为衡量参数，分析VEGF和endostatin蛋白的表达量。

1.3.5 化学发光免疫分析法(CLIA)和放射免疫法(RIA)检测 给药4周后，麻醉大鼠后股动脉取血，4℃过夜凝固，3.5 × 103r·min－1离心 15 min，取血清。处死动物后，立即取出各组正常或异位内膜组织，各取25 mg内膜组织置于预冷的研钵中，液氮冷冻条件下捣碎成粉末，待液氮自然挥干后，加入0.4 ml无水乙醇，研磨，再加生理盐水1.6 ml，研磨成匀浆，3 ×103r·min－1离心 10 min，吸取上清。血清样品测定E2和PGE2的含量，组织上清测定PGE2的含量，随后操作严格按照试剂盒的要求进行。

1.4 统计学分析计量资料数据以±s表示，采用SPSS 13.0统计软件包进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 加味佛手散对大鼠异位子宫内膜移植物体积的影响给药4周后，模型对照组大鼠的异位子宫内膜移植物体积前后自身对照无差异;加味佛手散0.045、0.09、0.18 g·kg－1和孕三烯酮 0.5 mg·kg－1异位子宫内膜移植物体积与模型对照组相比差异有显著性(P＜0.01)，提示加味佛手散有明显抑制大鼠异位子宫内膜移植物体积的作用(Tab 1)。

Tab 1 Effects of Jiawei Foshousan on ectopic endometrial tissue volum size of EMS rats(±s，n=10)

Tab 1 Effects of Jiawei Foshousan on ectopic endometrial tissue volum size of EMS rats(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs model group

Group Dose Volume of ectopic endometrial tissue/mm3 Inhibition ratio Before After /%Model － 43.2 ±34.7 47.0 ±34.1 Gestrinone 0.5 mg·kg－1 40.9 ±31.8 14.0 ±12.8＊＊68.95 Jiawei 0.045 g·kg－1 36.2 ±26.5 15.8 ±12.4＊＊54.19 Foshousan 0.09 g·kg－1 49.1 ±34.2 15.1 ±13.8＊＊62.65 0.18 g·kg－1 51.1 ±35.9 17.8 ±15.6＊＊65.71

2.2 加味佛手散对大鼠异位内膜细胞HE染色形态结构的影响显微镜镜下观察移植物成活的子宫内膜组织，形成的囊壁由内向外依次为腔上皮细胞层、间质细胞层及少量纤维结缔组织。模型对照组移植物的纵切面上，异位内膜有囊肿形成，囊壁厚;腺体数目多，腺体上皮细胞呈高柱状或矮柱状，排列在囊泡内腔面，呈多层细胞排列，细胞间连接较紧密，细胞核大，呈椭圆形，胞质丰富;内膜间质丰富，其中个别部位上皮层内陷形成假腺体。加味佛手散0.18 g·kg－1异位内膜腺上皮层明显变薄，细胞呈矮柱状甚至扁平状，呈单层细胞排列，松散排列，腺腔小，未见假腺体改变(Fig 1)。

Fig 1 HE staining of in ectopic endomembrane of rats(HE×100)

2.3 加味佛手散对EMS大鼠异位子宫内膜微血管密度(MVD)值的影响Ⅷ因子阳性细胞胞质染色为棕黄色，阳性染色细胞呈黄色或棕黄色，主要是血管内皮细胞和腺上皮细胞。模型对照组阳性细胞数量多且密集，明显高于正常组，二者差异有显著性(P＜0.01)，显示造模成功。加味佛手散0.18 g·kg－1和孕三烯酮0.5 mg·kg－1阳性染色细胞数量与模型组比较明显减少(P＜0.01)，加味佛手散0.09 g·kg－1阳性染色细胞数量较模型组明显减少(P＜0.05)，提示加味佛手散可能是通过抑制大鼠异位组织MVD而达到抑制血管生成［Fig 2A(a、b)、B(a)，Fig 2A(a、b)、B(a)］。

2.4 加味佛手散对EMS大鼠异位子宫内膜VEGF和endostatin蛋白表达的影响免疫组织化学结果显示，VEGF和endostatin阳性细胞胞质染色为棕黄色，在异位组织腺上皮细胞及间质细胞胞质内可见阳性表达，如图中箭头所示。

VEGF蛋白在模型对照组中，阳性细胞数量多且密集，明显高于正常对照组，二者差异有显著性(P＜0.01)。加味佛手散0.18 g·kg－1和孕三烯酮0.5 mg·kg－1阳性染色细胞数量与模型组比较明显减少(P＜0.01)，加味佛手散 0.09 g·kg－1与模型组比较明显减少(P＜0.05)，Western blot半定量分析与上述免疫组化结果一致，提示加味佛手散可抑制大鼠异位内膜 VEGF的表达［Fig 2A(c、d)、B(b)、Fig 3、Tab 2］。

Fig 2 Immunohistochemical staining of factorⅧ、VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of rats(SP ×400)

endostatin蛋白在模型对照组中，阳性细胞数量较少且染色较浅，明显低于正常对照组，二者差异有显著性(P＜0.01)。加味佛手散0.18 g·kg－1和孕三烯酮0.5 mg·kg－1阳性染色细胞数量与模型对照组比较明显增加(P＜0.01)，Western blot半定量分析与上述免疫组化结果一致，提示加味佛手散可促进大鼠异位内膜endostatin蛋白的表达［Fig 2A(e、f)、B(c)、Fig 3、Tab 2］。

Fig 3 Western blot analysis of the effect of Jiawei Foshousan on the expression of VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of rats

Tab 2 Effects of Jiawei Foshousan on the expression of VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of EMS rats( ± s，n=8)

Tab 2 Effects of Jiawei Foshousan on the expression of VEGF and endostatin in ectopic endomembrane of EMS rats( ± s，n=8)

##P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Dose VEGF/β-actin endostatin/β-actin Control － 0.22 ±0.04 0.024 ±0.003 Model － 0.44 ±0.03## 0.011 ±0.002##Gestrinone 0.5 mg·kg－10.24 ±0.03＊＊ 0.020 ±0.002＊＊Jiawei Foshousan 0.045 g·kg－1 0.41 ±0.02 0.012 ±0.003 0.09 g·kg－1 0.39 ±0.03* 0.013 ±0.002 0.18 g·kg－1 0.23 ±0.02* 0.021 ±0.002＊＊

2.5 加味佛手散对大鼠血清和异位内膜PGE2含量的影响放免法结果显示，模型对照组大鼠血清和异位内膜组织中PGE2的含量与正常对照组相比明显增高(P＜0.01)。加味佛手散0.18 g·kg－1及孕三烯酮0.5 mg·kg－1可明显降低模型大鼠血清和异位内膜组织中PGE2的含量(P＜0.01)，加味佛手散0.09 g·kg－1与模型对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，提示加味佛手散能够降低大鼠血清和子宫内膜中PGE2的表达(Tab 3)。

3 讨论

EMS的发病机制尚不明确，比较公认的是经血逆流种植学说［5］，该学说认为有活力的子宫内膜组织和细胞在月经期间通过输卵管到达腹部，通过酶降解和血管生成侵袭间皮细胞层和基底膜而附着于腹壁。EMS存在过度的血管生成［6］，具有类似恶性肿瘤的特征，抗血管生成治疗已成为治疗EMS的研究热点［1］。血管生成是许多促进或抑制血管生成的分子参与调节的一个平衡过程［7］，VEGF是一个最重要的血管生成促进因子，可以促进血管内皮细胞的迁移和分裂增殖［8］。PGE2能提高VEGF的表达，促进血管生成［1］。endostatin是一种强效内源性血管生成抑制因子，可特异性抑制内皮细胞粘附、迁移和增殖，诱导其凋亡，发挥抑制血管生成的作用［9］。本试验模型大鼠异位内膜组织中微血管密度、VEGF的表达较正常对照组升高，而 endostatin的表达较正常对照组降低。研究结果显示，加味佛手散能降低大鼠异位内膜组织体积和MVD，并能够抑制大鼠异位内膜组织中VEGF蛋白的表达，降低大鼠血清和异位内膜组织中PGE2的含量，促进endostatin蛋白的表达。

Tab 3 Effects of Jiawei Foshousan on the concentration of PGE2 in blood serum and ectopic endomembrane of EMS rats(±s，n=8)

Tab 3 Effects of Jiawei Foshousan on the concentration of PGE2 in blood serum and ectopic endomembrane of EMS rats(±s，n=8)

##P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

PGE 2 Group Dose Blood serum/μg·L－1 Ectopic endomembrane/ng·g －1 Control － 0.42 ±0.13 34.10 ±3.10 Model － 0.81 ±0.11## 47.61 ±5.04##Gestrinone 0.5 mg·kg－10.52 ±0.07＊＊ 35.36 ±3.57＊＊Jiawei Foshousan 0.045 g·kg－10.72 ±0.08 43.86 ±7.49 0.09 g·kg－10.68 ±0.10* 39.96 ±5.43*0.18 g·kg－10.50 ±0.10＊＊ 35.92 ±6.37＊＊

加味佛手散是由川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素3个中药有效成分单体组成，现代药理学研究发现［10－12］川芎嗪和阿魏酸钠均具有抗肿瘤血管生成作用，并能抑制VEGF的表达，延胡索乙素具有抑制中枢神经系统，松弛子宫平滑肌，影响内分泌等作用［13］。课题组前期研究表明，川芎嗪和阿魏酸合用在药代动力学方面互相影响，具有缓释效果［14］。本研究首次报道川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素配伍合用对大鼠EMS模型的抑制作用，及其抑制异位内膜血管生长的机制。加味佛手散对雌激素的调节、免疫系统功能的影响有待于进一步研究。

［1］ Becker C M，D'Amato R J.Angiogenesis and antiangiogenic therapy in endometriosis［J］.Microvascul Res，2007，74(2 － 3):121 －30.

［2］ Lebovic D，Kir M，Casey C.Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma induces regression of endometrial explants in a rat model of endometriosis［J］.Fertil Steril，2004，82(3):1009 － 13.

［3］ 楚 博，江 涛，龚梦娟，等.正交试验优化大鼠子宫内膜异位症模型［J］.中国药理学通报，2009，25(7):973 －5.

［3］ Chu B，Jiang T，Gong M J，et al.Optimizing the establishment of endometriosis model in rats by orthogonal experiment［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):973 －5.

［4］ Vlahos N F，Gregoriou O，Deliveliotou A，et al.Effect of pentoxifylline on vascular endothelial growth factor C and fik-1 expression on endometrial implantsin the rat endometriosis model［J］.Fertil Steril，2009，93(4):1316 －23.

［5］ Kodati V L，Govindan S，Mowa S，et al.Role of shigella infection in endometriosis:A novel hypothesis［J］.Med Hypoth，2008，70(2):239－43.

［6］ Fan T P，Yeh J C，Leung K W，et al.Angiogenesis:from plants to blood vessels［J］.Trends Pharmacl Sci，2006，27(6):297 －309.

［7］ 吴家明，陆 茵，张伟伟，等.血管生成实验模型研究进展［J］.中国药理学通报，2008，24(1):11 －4.

［7］ Wu J M，Lu Y，Zhang W W，et al.The advances of angiogenesis assay models［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):11 －4.

［8］ 陈 怡，徐晓玉，叶 兰，等.三棱丸抑制大鼠子宫内膜异位症血管生成及 VEGF，TNF-α表达的研究［J］.中国中药杂志，2008，33(3):303 －7.

［8］ Chen Y，Xu X Y，Ye L，et al.Inhibitory effects of Sanleng pellet on angiogenesis of endometriosis in rats［J］.China J Chin Mat Med，2008，33(3):303 －7.

［9］ 黄学应，陈飞虎，张晓明，等.内抑素抗血管生成及抗类风湿性关节炎治疗［J］.中国药理学通报，2009，25(3):287 －9.

［9］ Huang X Y，Chen F H，Zhang X M，et al.Endostatin:antiangiogenic properties and the therapeutic effect on rheumatoid arthritis［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):287 －9.

［10］徐晓玉，严鹏科，陈 刚，等.川芎嗪对小鼠肺癌血管生长和VEGF表达的抑制［J］.中国药理学通报，2004，20(2):151－4.

［10］ Xu X Y，Yan P K，Chen G，et al.Inhibition of tetramethylpyrazine on Lewis lung carcinomas，microvessel growth and VEGF expression in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(2):151 －4.

［11］陈 刚，徐晓玉，叶 兰，等.川芎嗪对大鼠胶原性关节炎滑膜VEGF及VEGF mRNA表达的影响［J］.中国药理学通报，2006，22(10):1199 －202.

［11］ Chen G，Xu X Y，Ye L，et al.Effects of tetramethylpyrazine on the expression of vascular endothelial growth factor in synovium of collagen-induced arthritis in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(10):1199－202.

［12］徐晓玉，陈伟海，叶 兰，等.阿魏酸钠和白芍总苷对小鼠H22肿瘤生长与血管内皮细胞生长因子及增殖细胞核抗原表达的影响［J］.中草药，2007，38(4):570 －3.

［12］ Xu X Y，Chen W H，Ye L，et al.Effect of sodium ferulate and total glucosides in paeony on tumor growth and expression of vascular endothelial growth factor and proliferating cell nuclear antigen in H22mice［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2007，38(4):570 － 3.

［13］徐晓玉.祛因治病药［M］//徐晓玉.中药药理学.北京:中国中医药出版社，2010:288－91.

［13］ Xu X Y.The drugs for etiological treatment aimed at pathogenesis［M］//Xu X Y.Pharmacology of chinese materia medica.Beijing:China Press of Traditional Chinese Medicine，2010:288 －91.

［14］冯彬彬，张建海，徐晓玉，等.川芎嗪、阿魏酸及其配伍药代动力学比较研究［J］.中国中药杂志，2010，35(7):900 －3.

［14］ Feng B B，Zhang J H，Xu X Y，et al.Comparative study on pharmacokinetics of tetramethylpyrazine，ferulic acid and their compatibility［J］.China J Chin Mater Med，2010，35(7):900 －3.