王杰琼，张惠云

(山东中医药大学中医药经典理论教育部重点实验室，山东济南 250355)

情志与健康和疾病的关系，尤其是负性情绪对健康和疾病的影响已成为当今全社会关注的焦点。中医七情中怒是负性情绪中最不可忍受、对人际关系与社会和谐影响最大、与疾病发生关系最为密切的情绪反应之一。乔明琦等［1］认为怒有愤怒和郁怒两种形式，愤怒表现为发怒后向他人发泄，郁怒表现为发怒后不发泄而郁于心中。Bridewell等［2］认为愤怒和郁怒分别对焦虑和抑郁及其相关症状产生起重要作用。为探索愤怒、郁怒诱发病证的具体机制，我们通过基因芯片技术大规模、高通量检测愤怒、郁怒模型大鼠及药物处理模型大鼠的海马基因表达，发现:愤怒、郁怒情志可导致海马多种基因的表达水平改变，本文通过RT-PCR和Western blot检测5-HTR2C在大鼠海马中mRNA和蛋白水平，从而为下一步的研究提供方向和线索。

1 材料与方法

1.1 动物及模型制备

1.1.1 动物 ♂Wistar大鼠，180 ～220 g，50 只，均由山东中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(鲁)20050015。

1.1.2 愤怒、郁怒大鼠模型制备 愤怒大鼠模型制备采用居住入侵结合社会隔离［3］的方法，分为正常组，愤怒、郁怒模型组，经前平、经前舒给药组，每组10只。

1.2 主要试剂经前平颗粒(扬子江药业集团四川海蓉药业有限公司生产，生产批号:07102501)、经前舒颗粒(秦皇岛市山海关制药厂生产，生产批号:Z20053587)。UNIQ-10柱式总RNA抽取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)、RNase Inhibitor(日本TOYOBO公司);RT-PCR反应试剂包括MMLVReverse、dNTP Mixture、rTaq、DNase I(大连TaKaRa生物公司)。引物合成由济南博亚生物工程技术服务有限公司完成。5-HTR2C一抗(sc-1464)、β-actin一抗(sc47778)均购自美国Santa Cruz公司;驴抗羊二抗(美国Santa Cruz公司);驴抗兔二抗(美国Abcam公司);预染蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司);protease inhibitor cocktail(美国Sigam公司);BeyoECL Plus购自碧云天生物技术研究所。

1.3 大鼠脑组织取材共有5组大鼠(n=10/组):正常组、愤怒组、愤怒用药组、郁怒组、郁怒用药组。每只大鼠被断头、开颅、分离脑置于冰上培养皿中，无菌操作取出海马，分别置于Ep管中，液氮保存。

1.4 大鼠密切相关基因确定

1.4.1 大鼠基因芯片检测 选5组大鼠右侧海马，干冰保存运输至上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心。选用Affymetrix大鼠基因组芯片，由上海生物芯片有限公司/生物芯片上海国家工程研究中心完成芯片检测及数据统计。结果采用Affymetrix扫描仪进行扫描，GCOS 1.4软件读取、处理数据。与正常组大鼠相比较，差异基因筛选标准是Log2信号比值≥0.8(即基因表达水平比值≥1.74)。在初始数据基础上，运用专业软件分别进行pathway、GO、GSEA等进一步的统计分析。

Tab 1 Primer sequences and the product lengths

1.4.2 明确密切相关基因 根据基因芯片初始数据和初步统计分析结果，通过查阅文献，比对基因，初步明确分别与愤怒和郁怒密切相关基因:5-HTR2C、GABABR2和 5-HTR3B。本文仅对 5-HTR2C在大鼠海马中的表达做进一步研究。

1.5 大鼠海马中5-HTR2C基因表达水平检测

1.5.1 RT-PCR检测5-HTR2C在大鼠海马中 mRNA表达变化 用TRIzol法提取大鼠海马总RNA，测定其浓度后，－80℃保存。参照M-MLV反转录酶说明书进行反转录，根据目的cDNA序列，用引物设计软件(primer 3)设计引物，由济南博亚生物工程技术服务有限公司合成。建立20 μl PCR反应体系:2.5 mmol·L－1dNTP 2.0 μl，10 × PCR buffer 2.0 μl，上游引物 0.3 μl，下游引物 0.3 μl，模板 cDNA 1.0 μl，5 U/μl rTaq 聚合酶 0.2 μl，ddH2O 14.2 μl。PCR反应条件为预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 s，退火40 s，延伸72℃ 1 min，不同循环数，再72℃延伸7 min。引物序列及退火温度和最佳循环数见Tab 1。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪成像。以β-actin作为内参按照下列公式计算各基因的mRNA相对表达水平:被检测基因表达水平=被检测基因电泳条带光密度值/β-actin电泳条带光密度值。

1.5.2 Western blot检测

1.5.2.1 蛋白提取及定量 取出海马，冰浴中操作，按1∶5的比例(mg·μl－1)加入提前预冷的RIPA裂解液(含0.01 mol·L－1的 PMSF和 cocktail)，匀浆器匀浆 30 min，4℃ 下12 000 r·min－1离心 5 min，取上清，采用Bradford法测定蛋白含量，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，置于沸水中煮5 min 使蛋白变性，12 000 r·min－1离心 5 min，取上清，－20℃保存。

1.5.2.2 Western blot检测 以30 ～50 μg/泳道上样，经SDS-PAGE电泳分离后，湿法转移至 NC膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h，分别与5-HTR2C 一抗(ab44635，1 ∶200)、β-actin一抗(M1821，1∶1 500)室温摇床孵育2 h(抗体均用5%脱脂奶粉的TBST溶液稀释)，TBST洗膜3次，10 min/次，再与辣根氧化酶标记的相应二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，10 min/次，ECL化学发光试剂检测杂交信号，显影于X线片上，用凝胶成像分析仪在可见光透射下对X线片进行扫描和图像分析。5-HTR2C与内参β-actin做灰度比值，以此作为所测样品中相应指标的相对表达量。

1.6 数据统计方法利用SPSS 16.0统计软件，单因素方差分析及LSD检验法统计数据。

2 结果

2.1 RT-PCR检测5-HTR2C在大鼠海马中mRNA表达水平以β-actin作为内参，5-HTR2C mRNA表达量的光密度扫描显示，与正常组相比较，5-HTR2C mRNA相对水平在愤怒组大鼠海马中增加(P＜0.01)，在郁怒组海马中增高(P＜0.01)，愤怒组大鼠海马中5-HTR2C mRNA相对表达水平改变明显强于郁怒组大鼠;用药后，与模型组相比较，5-HTR2C mRNA改变得到改善(Fig 1、2)。

Fig 1 The expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

Fig 2 The expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

2.2 Western blot检测大鼠海马的5-HTR2C蛋白水平以β-actin作为内参，5-HTR2C蛋白表达量的光密度扫描显示，与正常组相比较，5-HTR2C蛋白相对水平在愤怒组大鼠海马中增高(P＜0.01)，在郁怒组大鼠海马中增高(P＜0.01);用药后，与模型组相比较，给药组大鼠海马的5-HTR2C蛋白改变均得到改善(Fig 3、4)。

Fig 3 The protein expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

Fig 4 The expression of 5-HTR2C mRNA in hippocampal of rats

3 讨论

前期研究显示，面对经历的生活事件，有人愤怒发火，有人则郁怒生闷气，进而呈现肝疏泄太过或不及相应症状［4］。严灿等［5］认为，肝主疏泄之所谓“疏泄”，其中枢神经生物学机制在整体上与调节下丘脑—垂体—肾上腺轴有关，表现出多层次、多靶点以及多环节的作用特点;作用的脑区涉及到下丘脑(包括不同核团)、海马、杏仁核等。据报道［6］海马是学习记忆功能的关键脑区，故对相关基因进行深入研究。

3.1 基因芯片筛选愤怒、郁怒相关基因本次研究中，运用基因芯片技术检测了愤怒、郁怒模型大鼠及药物干预模型大鼠海马的基因表达情况。基因芯片选用了Affymetrix大鼠基因组芯片，以大鼠海马提取的总RNA中的mRNA为模板，通过RT-PCR反应生成cDNA，与芯片进行杂交反应。检测结果显示:愤怒组中5-HTR2C基因表达差异性增高、GABAR2B基因差异性降低，郁怒组中5-HTR3B基因表达差异性增高。已有的报道显示，上述3个基因与焦虑、易激惹、狂躁易怒、抑郁均有关［7－10］。这不仅从侧面证明了模型制备的有效性，更提示愤怒、郁怒情志诱发病证机制涉及上述3个基因及其相关信号通路，从而为下一步的研究提供了线索和初步依据。本次研究仅对5-HTR2C基因表达做进一步的探索。

3.2 检测5-HTR2C在模型组大鼠海马的mRNA和蛋白表达水平5-HTR2C作为5-HT受体之一，属于G蛋白偶联受体，在啮齿类动物中枢神经系统内分布较广，脉络丛、下丘脑、纹状体、额区皮质、海马、杏仁核等均有表达［11］。近年来的报道证实该基因与情绪关系密切。5-HTR2C可以抑制去甲肾上腺素和多巴胺的释放［12］，从而调节情绪、焦虑、摄食和生殖行为［13］。

从 RT-PCR结果可看出:与正常组相比，5-HTR2C mRNA的相对水平在愤怒组和郁怒组大鼠海马内增高(P＜0.01)，而且愤怒组的改变程度明显大于郁怒组，表明5-HTR2C与愤怒的相关性更大。Western blot的结果显示:5-HTR2C蛋白水平在愤怒组与郁怒组大鼠海马的改变趋势与其mRNA的改变一致，但改变程度相对小，说明该基因的表达水平改变主要在基因转录阶段。同时也说明愤怒、郁怒作为怒的两种不同形式，在导致5-HTR2C水平改变的脑区方面以共性为主，但与大鼠愤怒更为相关。

另外，本实验中运用了调肝方药经前平与经前舒颗粒分别干预愤怒和郁怒情绪反应模型大鼠。由结果可看到，模型用药组与模型组相比较，各项指标绝大多数差异都呈显著性，与正常组相比较差异则无显著性，说明用药后能改善造模对5-HTR2C表达水平的影响，使其基本恢复正常，所用调肝方药干预效果明显。同时，也从侧面证实，愤怒、郁怒情绪均与肝功能失常有关。

综上所述，5-HTR2C是愤怒/郁怒情绪反应大鼠模型的密切相关基因，调肝方药可有效干预上述愤怒/郁怒大鼠模型5-HTR2C的表达，使其基本恢复正常水平，说明5-HTR2C是两种调肝方药的作用靶点。

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