孙学成 廖专 李兆申

·论著·

肥胖抑制素对大鼠胰腺腺泡和胰腺小叶淀粉酶分泌的影响

孙学成 廖专 李兆申

目的研究不同剂量肥胖抑制素(Obestatin)对大鼠离体胰腺腺泡及胰腺小叶淀粉酶分泌的影响。方法体外分离大鼠胰腺腺泡，与不同浓度Obestatin (0、0.1、1、10、30 nmol/L)共培养1 h；另一组加Obestatin 30 min后加入100 pmol/L的胆囊收缩素(CCK-8)继续培养30 min。分离含有胰腺内神经末端、胰岛细胞及外分泌细胞的胰腺小叶，与不同浓度Obestatin共培养30 min；另一组加Obestatin同时加75 mmol/L KCl共培养30 min。测定培养液及细胞或胰腺小叶组织内淀粉酶含量，计算淀粉酶分泌率。结果0、0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin不影响胰腺腺泡细胞淀粉酶分泌率[(3.48±1.44)%、(3.70±1.39)%、(3.36±1.24)%、(3.86±1.41)%、(4.54±2.01)%]。CCK-8能显著刺激腺泡细胞的淀粉酶分泌率[(13.84±2.63)%比(3.48±1.44)%，P<0.05]，但0.1、1、10 nmol/L Obestatin对CCK-8诱导的胰腺腺泡淀粉酶分泌无显著性影响[(14.55±1.70)%、(13.79±1.81)%、(14.39±1.12)%]。Obestatin(0.1、1、10、30 nmol/L)不影响胰腺小叶淀粉酶分泌率。KCl可显著刺激胰腺小叶淀粉酶分泌率[为对照组的(1.84±0.29)倍，P<0.05]，但Obestatin对KCl诱导的胰腺小叶淀粉酶分泌无显著影响[为对照组的(2.01±0.30)、(1.89±0.41)、(1.74±0.14)、(1.88±0.33)倍]。结论Obestatin对体外培养的大鼠胰腺腺泡细胞及胰腺小叶淀粉酶分泌率无显著影响，也不能阻断或协同CCK-8和KCl对胰腺淀粉酶分泌的促进作用。

胰腺； 肥胖抑制素； 胰腺腺泡； 淀粉酶； 胆囊收缩素

肥胖抑制素(Obestatin)是从胃组织内提取的由23个氨基酸组成的脑肠肽，它与孤儿G蛋白GPR39受体结合，产生与食欲刺激素(Ghrelin)相拮抗的生理作用[1]。但也有研究得出不同的结果[2-3]。本研究应用不同剂量的Obestatin与体外分离的大鼠胰腺腺泡、胰腺小叶共同培养，并给予胆囊收缩素(CCK-8)或KCl刺激，观察细胞内和细胞外淀粉酶分泌的变化，为研究Obestatin对胰腺分泌功能的影响提供实验依据。

材料与方法

一、胰腺腺泡和胰腺小叶制备

健康雄性SD大鼠，清洁级， 2～3个月龄，体重200～250 g，购自第二军医大学动物实验中心。适应性饲养1周。实验前禁食12 h，以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，在无菌条件下取出大鼠胰腺。

参照Williams等[4]方法制备胰腺腺泡。将胰腺置入10 ml新鲜配制的KRB缓冲液(127 mmol/L NaCl,1.28 mmol/L CaCl2,0.55 mmol/L MgCl2,4.7 mmol/L KCl,0.55 mmol/L Na2HPO4,10 mmol/L Hepes,11 mmol/L glucose,2 mmol/L glutamine,1% Eagele′s, 0.1 mg/ml大豆胰酶抑制剂，10 mg/ml胎牛血清，pH 7.4)中剔除脂肪和淋巴组织。将5 ml(0.3 mg/ml)的胶原酶溶液分点注入到胰腺间质中，5 min后将胰腺组织剪成0.5～2 mm大小，移至无菌培养瓶中，充入100%氧气，37℃震荡水浴中消化50 min，加入4%胎牛血清，无针头注射器轻轻吹打，150 μm尼龙筛网过滤，所得细胞于常温下50 g离心3 min，用HRB溶液再悬浮细胞，充入100%氧气后于37℃孵育30 min，获取的细胞行HE染色和亚甲蓝染色鉴定，腺泡细胞活性率>90%。

参照Scheele和Palade[5]方法提取胰腺小叶。将胰腺放入KHB溶液(110 mmol/L NaCl, 1.8 mmol/L CaCl2, 1.1 mmol/L MgCl2,4.7 mmol/L KCl, 1.1 mmol/L Na2HPO4, 25 mmol/L NaHCO3,25 mmol/L Hepes,11 mmol/L glucose, 2 mmol/L glutamine,0.1 mg/ml大豆胰酶抑制剂，1% Eagele′s，pH 7.4)中剔除脂肪和淋巴组织，沿胰腺间质将胰腺剪成大小4 mm×5 mm小叶单位，KHB洗涤后移入培养瓶，每个培养瓶加入4.5 ml培养液和3个胰腺小叶，充入100%氧气，37℃下孵育30 min恢复小叶功能。

二、实验分组

用HRB溶液将腺泡细胞调至105/ml密度，取0.9 ml加入培养皿中，共9个培养皿。4个培养皿分别加入1 ml终浓度分别为0、0.1、1、10、30 nmol/L的 Obestatin(Phoenix Pharmaceuticals公司)培养1 h。另4个培养皿分别加入1 ml终浓度分别为0、0.1、1、10 nmol/L的Obestatin培养30 min，再加入100 pmol/L的CCK-8(北京康肽生物有限公司)继续培养30 min。实验重复2次。

将0.5 ml Obestatin分别加入10只装有胰腺小叶的培养瓶(终浓度分别为 0、0.1、1、10、30 nmol/L)，每个浓度2只培养瓶，其中之一同时加入75 mmol/L的KCl培养30 min。实验重复4次。

三、淀粉酶分泌率测定

将腺泡细胞悬液50 g离心3 min，取上清液100 μl，应用日本HITACHI-7150自动生化分析仪测定淀粉酶活性。沉淀的腺泡细胞加入1 ml HRB，超声破碎5 min，离心后取等量100 μl上清液测定细胞内淀粉酶活性。淀粉酶分泌率(%)=上清淀粉酶/(细胞内淀粉酶+上清淀粉酶)×100%。

取胰腺小叶培养上清液100 μl测定淀粉酶活性，弃上清后的胰腺小叶加1 ml KHB溶液，超声破碎后离心取上清，稀释10倍，测定淀粉酶活性。同法计算淀粉酶分泌率，结果以药物处理组与对照组的倍数表示。

四、统计学处理

结 果

一、胰腺腺泡细胞淀粉酶分泌率

对照组腺泡细胞的淀粉酶分泌率为(3.48±1.44)%，与0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin共培养1 h后，细胞淀粉酶分泌率分别为(3.70±1.39)%、(3.36±1.24)%、(3.86±1.41)%、(4.54±2.01)%，无明显增高(P>0.05)。腺泡细胞与CCK-8共培养后，细胞淀粉酶分泌率明显升高至(13.84±2.63)%(P<0.05)，加入0.1、1、10 nmol/L Obestatin培养1 h后，淀粉酶分泌率为(14.55±1.70)%、(13.79±1.81)%、(14.39±1.12)%，均显著高于不加CCK-8的药物组(P<0.05)，而与单加CCK-8组比较差异无统计学意义。

二、胰腺小叶淀粉酶分泌率

0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin与胰腺小叶共育30 min后，淀粉酶分泌率分别为对照组的(1.11±0.23)、(1.03±0.35)、(0.96±0.26)、(0.98±0.17)倍，无明显增高。应用75 mmol/L KCl刺激后，胰腺小叶淀粉酶分泌率明显升高至对照组的(1.84±0.29)倍(P<0.05)，但加入0.1、1、10、30 nmol/L Obestatin培养1 h后，淀粉酶分泌率分别为对照组的(2.01±0.30)、(1.89±0.41)、(1.74±0.14)、(1.88±0.33)倍，均显著高于对照组(P<0.05)，但与单加KCl组比较差异无统计学意义。

讨 论

Zizzari等[6]报道，外源性Obestatin腹腔注射后呈时间和剂量依赖性地抑制小鼠摄食量；脑室注射可以减少小鼠摄食量，抑制体重增加，抑制胃排空，减少空肠平滑肌收缩力，拮抗Ghrelin的刺激效应。但也有报道Obestatin对摄食量、体重、胃排空均无影响[7]。胰腺外分泌受到包括脑肠肽在内的体液和神经等多个因素的调节，已有的研究表明，CCK、胰泌素、胰多肽(PP)等可以通过迷走神经或直接的方式刺激胰腺外分泌，而神经肽Y和生长抑素可以抑制胰腺外分泌。Kapica等[8]报道，经十二指肠和静脉分次给予Obestatin可以剂量依赖性地通过迷走神经刺激胰蛋白酶分泌，但对胰液分泌量无影响。我们前期实验也显示，小剂量Obestatin连续静脉给药对大鼠胰腺外分泌并无影响。

胰腺腺泡细胞可分泌蛋白质、淀粉酶和脂肪酶，因此单位时间内淀粉酶含量的变化可以反映胰液外分泌的变化。由于大鼠自身Obestatin分泌存在昼夜节律性，并且受多因素影响，所以本实验严格控制动物饲养条件，统一实验时间，并采用重复实验的方法控制误差。结果显示，不同剂量的Obestatin对胰腺腺泡和胰腺小叶的淀粉酶分泌无影响；CCK-8可刺激胰腺腺泡淀粉酶，KCl可刺激胰腺小叶淀粉酶分泌，但Obestatin不能阻断或协同CCK-8和KCl对胰腺淀粉酶的促分泌作用，与Moechars等[9]的研究结果一致。由于胰腺外分泌受到复杂的神经体液网络调控，多因素、多环节的调节使我们的体外实验有一定局限性。另外生理条件下体内Obestatin以pmol为单位，而本实验应用nmol，因此需要进一步的实验来进行验证。

[1] Zhang JV, Ren PG, Avsian-Kretchmer O, et al. Obestatin, a peptide encoded by the ghrelin gene, opposes ghrelin′s effects on food intake. Science,2005,310:996-999.

[2] De Smet B，Thijs T，Peeters TL，et al．Effect of peripheral obestatin on gastric emptying and intestinal contractility in rodents．Neurogastroenterol Motil， 2007,19：211-217.

[3] Depoortere I，Thijs T，Moechars D，et al．Effect of peripheral obestatin on food intake and gastric emptying in ghrelin-knockout mice．Br J Pharmacol, 2008,153：1550-1557.

[4] Williams JA, Lee M. Microtubules and pancreatic amylase release by mouse pancreas in vitro. J Cell Biol,1976,71:795-806.

[5] Scheele GA, Palade GE, Tartakoff AM.Cell fractionation studies on the guinea pig pancreas. Redistribution of exocrine proteins during tissue homogenization.J Cell Biol,1978,78:110-130.

[6] Zizzari P，Longchamps R, Epelbaum J，et al．obestatin partially affects ghrelin stimulation of food intake and growth hormone secretion in rodents．Endocrinology,2007,148：1648-1653.

[7] Tremblay F，Perreault M，Klaman LD，et al．Normal food intake and body weight in mice lacking the G protein-coupled receptor GPR39．Endocrinology,2007,148：501-506.

[8] Kapica M, Zabielska M, Puzio I,et al.Obestatin stimulates the secretion of pancreatic juice enzymes through a vagal pathway in anaesthetized rats-preliminary results.J Physiol Pharmacol, 2007,58:123-130.

[9] Moechars D，Depoortere I，Moreaux B，et al．Altered gastro-intestinal and metabolic function in the GPR39-obestatin receptor-knockout mouse． Gastroenterology，2006，131：1131-1141．

2011-01-11)

(本文编辑：屠振兴)

Effectsofobestatinonamylasereleaseofpancreaticacinarcellsandlobulesofrats

SUNXue-cheng,LIAOZhuan,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIAOZhuan,LIZhao-shen,Email：Liaozhuan@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the effects of different doses of obestatin on amylase secretion of pancreatic acinar and lobules of rats in vitro.MethodsPancreatic acinar cells of rats were separated in vitro and incubated with different doses of obestatin (0, 0.1 ,1,10, 30 nmol/L) for 1h, another group of pancreatic acinar cells was incubated with obestatin for 30 min, then was incubated with 100 pmol/L CCK-8 for another 30 min. Pancreatic lobules, which containing intrapancreatic nerve terminals and islets, were prepared and were incubated with different concentrations of obestatin for 30 min at 37℃ with or without 75 mmol/L KCl. Amylase levels in the supernatants, acinar cells and pancreatic lobules were calculated as a percentage of total amylase content.ResultsObestatin (0, 0.1, 1, 10, 30 nmol/L) produced no significant change in basal amylase release of acinar cells[(3.48±1.44)%, (3.70±1.39)%, (3.36±1.24)%, (3.86±1.41)%, (4.54±2.01)%]. CCK-8 significantly increased amylase release of acinar cells[(13.84±2.63)%vs(3.48±1.44)%,P<0.05],but obestatin (0.1, 1, 10 nmol/L) has no effect on the amylase release induced by CCK-8 [(14.55±1.7)%, (13.79±1.81)%, (14.39±1.12)%]. Obestatin (0.1, 1, 10, 30 nmol/L) did not affect the amylase release of pancreatic lobule. KCl significantly increased amylase release, which was (1.84±0.29) folds higher than that of control group (P<0.05), but obestatin has no effect on the amylase release induced by KCl, which were (2.01±0.30), (1.89±0.41), (1.74±0.14), (1.88±0.33) folds higher than those of control group.ConclusionsExogenous obestatin has no effects on pancreatic exocrine of acinar cells and lobules of rats in vitro and cannot block or assist the increased amylase release induced by CCK-8 or KCl.

Pancreas; Obestatin； Pancreatic acinar； Amylase； Cholecystokinin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.013

国家自然科学基金青年科学基金(30800510)

200433 上海，第二军医大学附属长海医院消化科(孙学成、廖专、李兆申)；温州医学院附属第一医院消化科(孙学成)

廖专，李兆申，Email：Liaozhuan@hotmail.com