朱国英 朱风尚 黄东平 沈晓莹 宋振云 郜恒骏

·短篇论著·

牛磺胆酸钠诱导的急性坏死性胰腺炎大鼠基因表达谱变化

朱国英 朱风尚 黄东平 沈晓莹 宋振云 郜恒骏

基因芯片技术是高通量的差异基因表达研究手段。通过杂交后的生物信息学分析有助于全面了解复杂基因和信号转导通路在急性坏死性胰腺炎(ANP)中的作用。因此，利用全基因组表达谱方法分析ANP基因的变化较单个基因的研究具有理论上的优势。李磊等[1]曾报道，腹腔注射雨蛙肽诱导的急性水肿性胰腺炎(AEP)基因表达谱的变化，但尚未见类似临床重症急性胰腺炎(SAP)的ANP模型的胰腺组织基因表达谱的报道。故本实验观察ANP大鼠胰腺组织基因表达谱的变化。

一、材料与方法

1．动物分组及模型制备：SD大鼠40只，体重180～230 g，雌雄各半，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供(SPF级，合格证号：SCXK沪2003-0002)。按随机数字表法分为对照组和ANP组，各20只。适应性喂养1周后，参照文献[2]，采用胰管逆行注入4%牛磺胆酸钠(上海国药集团)0.1 ml/100 g体重方法制备ANP模型。对照组注入等容积的生理盐水。术后48 h记录存活率，处死大鼠，取血、胰腺组织。

2．血清淀粉酶和C-反应蛋白(CRP)检测：血清淀粉酶和CRP检测试剂盒购自上海丰翔生物科技有限公司，参照说明书操作。

3．胰腺组织病理检查：取固定的胰腺组织，常规切片、HE染色，光镜下观察组织病理变化，并采用Schmidt法[3]进行评分。

4．胰腺组织基因芯片分析：取液氮冻存胰腺组织，研磨成匀浆，离心取上清。常规Trizol法提取总RNA。采用Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒(上海芯超生物科技有限公司提供)完成RNA一步法逆转录反应合成cDNA和纯化，再由cDNA合成aaUTP标记的cRNA并纯化。用Cy-3标记cRNA探针，Illumina杂交试剂盒使cRNA探针片段化。将Illumina大鼠全基因组表达谱基因芯片置于Ilumina激光共聚焦光微珠芯片(Sentrix BeadChip)平台上与胰腺cRNA样本进行杂交。

以Illumina BeadChip Reader扫描系统获取数字信号，BeadStudio软件分析荧光信号强度和分析比值。以Cubic Spline法行归一化处理，筛选差异基因。用在线DAVID生物信息学分析工具(http:∥david.abcc.ncifcrf.gov)和Gene Ontology(GO)分类标准数据库(http:∥www.geneontology.org)分析差异表达基因涉及的生物学过程、分子功能和细胞组分[4]；采用KEGG数据库的基因信号通路分析差异基因涉及的生物学通路[5]。

5．差异基因F11r和Cdh1验证：采用荧光定量RT-PCR法。F11r(NM_053796)正义链5′-TGTCCTGGTAACACTGATTCTCC-3′，反义链5′-CAGGAATGACGAGGTCTGTTTG-3′，片段172 bp；Cdh1(NM_031334)正义链5′-CCTTGATGCCAGACCGGAAGT-3′，反义链5′-GGTCACTGTCCGCTGCCTTC-3′，片段140 bp；内参β-actin(NM_031144)正义链5′-TTTTGTGCCTTGATAGTTCGC-3′，反义链5′-GAGTCCTTCTGACCCATACCC-3′，片段264 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR条件：95℃ 3 min，94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 30 s，35个循环。通过ABI Prism 7500 SDS Software获得Ct值。ΔCt=Ct目标基因-Ct内参，mRNA相对表达量为2-ΔCt×100%。

6．统计学分析：采用SPSS13.0统计软件分析，其中正态分布计量资料用Student的t检验，率用χ2检验，非正态资料采用秩和检验。差异基因GO分类采用Fisher精确检验和χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1．动物48 h存活率及血清淀粉酶和CRP水平：对照组死亡2只，ANP组死亡8只，对照组存活率明显高于ANP组(P=0.028)。ANP组大鼠血清淀粉酶和CRP水平分别为(7892±1776)U/L、(106.5±19.9)mg/L，均显著高于对照组的(1296±326)U/L、(61.7±15.9)mg/L(P=0.000，P=0.002)。

2．胰腺病理改变：对照组胰腺轻度水肿，呈乳白色，无坏死；ANP组胰腺及周围脂肪呈黑褐色，坏死明显。对照组胰腺镜下见组织结构清晰，腺泡细胞内无空泡、间质无明显水肿、无白细胞浸润，病理评分为4.0±1.4；ANP组胰腺腺泡肿胀明显，大量空泡，不同程度坏死，间质有炎细胞浸润及出血，病理评分为10.3±2.2，较对照组明显升高(P=0.004)。

3．差异基因表达谱：比较对照组和ANP组胰腺全基因表达谱，共筛选到28个差异基因，其中上调23个，为regenerating islet-derived 3 gamma(Reg3g)；activating transcription factor 3(Atf3)；lamimin, gamma 2(Lamc2)；Rho family GTPase 1 (predicted) (Rnd1)；TG interacting factor (predicted) (Tgif)；potassium channel, subfamily K, member 1 (Kcnk1)；fucosyltransferase 2 (secretor status included) (Fut2)；RAB30, member RAS oncogene family(predicted) (Rsb30)；transformation related protein 53 inducible nuclear protein 1 (Trp53inp1)；coxsackie virus and adenovirus receptor (Cxadr)；keratin complex 2, basic, gene 8 (Krt2-8)；tetraspan 1 (MGC93753)；von Hippel-Lindau syndrome homolog (Vhl)；mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4 (predicted) (Map4k4)；UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 (predicted) (Galnt3)；tumor differentially expressed 2-like (predicted) (Tde2l)；iGb3 synthase (LOC171553)；adenosine monophosphate deaminase 3 (Ampd3)；B-cell translocation gene 2, anti-proliferative (Btg2)；24-dehydrocholesterol reductase (predicted) (Dhcr24)；fatty acid amide hydrolase (Faah)；junctional adhesion molecule 1 (F11r)；cadherin 1 (Cdh1)。下调5个，为ATPase, Ca2+transporting, ubiquitous (Atp2a3)；nephrosis 1 homolog, nephrin (human) (Nphs1)；methylcrotonoyl-Coenzyme A carboxylase 1 (alpha) (Mccc1)；hypothetical gene supported by BC087105 (LOC500856)；similar to Integral membrane protein 2A (LOC317218)。

通过GO分类得到32个GO注释条目，其中涉及生物学过程共10个GO，主要包括细胞黏附和黏附生物学、糖基化、Caspase活性调节、肽酶(含内肽酶)活性调节等过程。涉及的分子功能主要包括钙离子结合、金属离子跨膜转运蛋白活性(含阳离子)、水解酶/连接酶活性、碳水化合物结合、糖基转移酶活性等10个GO。涉及细胞组分方面的GO有9个，主要是细胞间连接、紧密连接、耦合连接、高尔基体功能等。在GO注释到的差异基因中被注释到频数最高的5个基因是：结合黏附分子-1受体(F11r)、钙黏蛋白-1(Cdh1)、遍在钙离子转运ATP酶(Atp2a3)、层黏蛋白-γ2(Lamc2)、柯萨奇和腺病毒受体(Cxadr)，其中Atp2a3为下调基因，F11r、Cdh1、Lamc2、Cxadr为上调基因。

获得KEGG生物学通路数据注释有3个，其中有9个差异基因，上调基因为8个(Cdh1、Vhl、F11r、Dhcr24、Ampd3、Galnt3、Fut2、Lamc2)，下调的有1个(Mccc1)，代表的生物学通路主要为细胞黏附分子通路、代谢通路、肿瘤信号通路，其中代表前两个通路的基因表达均上升。

4．差异基因验证：对感兴趣的细胞黏附分子通路中的两个基因F11r、Cdh1进行实时PCR验证。ANP组胰腺F11r、Cdh1 mRNA相对表达量分别是对照组的2.047、3.238倍，与基因芯片的比值2.657、3.151相吻合。

讨论Nakada等[6]报道雨蛙肽诱导的急性胰腺炎(AP)小鼠胰腺基因表达谱的变化，F11r和Cdh1mRNA表达明显升高。Dusetti等[7]用含7981个基因的小鼠表达谱芯片研究了正常和AP小鼠间胰腺组织差异基因，共发现239个基因变化，107个基因上调，132个基因下调，其中细胞黏附类基因在AP发病中起重要作用。Ji等[8]应用牛磺胆酸体外干预大鼠胰腺腺泡细胞，结果显示51个基因显著变化，并认为EGR-1是触发胰腺炎重要的调节因子。本结果显示，ANP时胰腺有28个基因表达发生明显变化。经过GO和Pathway筛选，均包含的差异基因中，F11r、Cdh1出现的频次和权重最高。这两个基因均参与钙离子和细胞黏附分子通路，提示传统的钙离子超载理论和细胞黏附分子改变在ANP发病中的重要作用在全基因表达谱上得到了证实。通过实时PCR对F11r、Cdh1mRNA的表达量进行验证，其结果和基因芯片一致，说明了基因芯片的可靠性。但F11r、Cdh1在ANP发病中的具体机制尚需进一步研究[9]。

细胞因子和炎症介质的放大在ANP发病中有重要作用，而本研究差异基因中没有表现出来，可能原因是时间节点较晚，而细胞因子大多已释放到外周血所致[10]。

[1] 李磊,王兴鹏,吴恺.雨蛙肽诱导的急性胰腺炎小鼠基因表达谱研究.中华医学杂志,2005,82:122-123.

[2] 朱国英,李永渝,李学礼.急性胰腺炎大鼠胰、肝组织IκBα的表达及中药新清胰汤的影响.中国病理生理杂志,2006,22:2438-2442.

[3] Deng LH, Xiang DK, Xue P, et al. Effects of Chai-Qin-Cheng-Qi Decoction on cefotaxime in rats with acute necrotizing pancreatitis. World J Gastroenterol, 2009, 15:4439-4443.

[4] Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protoc, 2009, 4:44-57.

[5] 陈蕾,王世鑫,刘萍,等.染矽尘大鼠早期肺组织差异基因表达谱的研究.中华预防医学杂志,2008,42:515-521.

[6] Nakada S, Tsuneyama K, Kato I, et al. Identification of candidate genes involved in endogenous protection mechanisms against acute pancreatitis in mice. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 391:1342-1347.

[7] Dusetti NJ,Tomasini R,Azizi A,et al.Expression profiling in pancreas during the acute phase of pancreatitis using cDNA microarrays.Biochem Biophys Res Commun,2000,277:660-667.

[8] Ji B, Chen XQ, Misek DE,et al. Pancreatic gene expression during the initiation of acute pancreatitis: identification of EGR-1 as a key regulator. Physiol Genomics, 2003, 14:59-72.

[9] Petersen OH.Ca2+signaling in pancreatic acinar cells: physiology and pathophysiology. Braz J Med Biol Res, 2009, 42:9-16.

[10] Dambrauskas Z, Giese N, Gulbinas A, et al. Different profiles of cytokine expression during mild and severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol, 2010, 16:1845-1853.

2011-01-07)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.021

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200060 上海，上海市普陀区人民医院院内感染科(朱国英)，普外科(黄东平)；同济大学附属同济医院消化疾病研究所(朱风尚，郜恒骏)；生物芯片上海国家工程研究中心(沈晓莹，宋振云，郜恒骏)

朱风尚，Email: zhufengshang@126.com