孙娟，舒强，凌光烈

（中国医科大学附属第一医院局解教研室，沈阳 110001）

替莫普利对大鼠血管平滑肌细胞弹性蛋白酶的影响

孙娟，舒强，凌光烈

（中国医科大学附属第一医院局解教研室，沈阳 110001）

目的研究替莫普利对大鼠球囊损伤动脉血管平滑肌细胞（VSMC）的弹性蛋白酶水平、表达和活性的影响。方法 建立大鼠损伤动脉再狭窄模型，实验组给予盐酸替莫普利，对照组给予药品溶剂。动脉损伤后第2、3、5天测定两组VSMC的弹性蛋白酶ⅢB阳性细胞率；采用原位杂交的方法测定两组弹性蛋白酶ⅡmRNA阳性细胞率；测定两组弹性蛋白酶活性值。动脉损伤后第3天对两组进行原位明胶酶谱分析。动脉损伤后第10天测定两组内膜面积。结果 替莫普利组与对照组比较，大鼠损伤动脉VSMC的弹性蛋白酶ⅢB、弹性蛋白酶ⅡmRNA阳性细胞率显著降低，弹性蛋白酶活性显著降低；同时明胶酶水平显著降低，内膜面积显著减小。结论替莫普利可能通过抑制大鼠损伤动脉VSMC的弹性蛋白酶水平、表达和活性及抑制明胶酶水平，抑制损伤动脉内膜肥厚。

再狭窄；血管紧张素转换酶抑制剂；血管平滑肌细胞；弹性蛋白酶

介入治疗是临床治疗动脉硬化最为迅速而有效的方法，然而术后30%～50%的再狭窄发病率严重影响了手术的成功［1］，多种治疗药物正在研究当中［2，3］。损伤动脉内膜肥厚的本质是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖、迁移至内膜并产生了细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。增生的VSMC向内膜的迁移更加活跃，迁移至内膜的VSMC具有高增殖性。本研究旨在明确损伤动脉VSMC增殖、迁移过程中弹性蛋白酶的变化以及血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）替莫普利对这一过程和对弹性蛋白酶、明胶酶的影响，从而明确ACEI抑制损伤动脉内膜肥厚的机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠损伤动脉再狭窄模型的建立和分组［4］

Wistar大鼠，雄性，12周龄，体质量220～250g，苯巴比妥钠（45mg/kg）腹腔注射麻醉。测定弹性蛋白酶活性时损伤主动脉，测定其他项目时损伤颈总动脉。将2Fr球囊导管（美国Baxter Healthcare公司）插入相应动脉，使球囊膨胀至动脉外径2倍，旋转提拉3次，使内皮剥离，中膜过度扩张。从动脉损伤前2d开始每日早晚各1次灌胃给药，实验组给予盐酸替莫普利（山东宏富达公司，每200mg溶于1L含NaHCO3和 KHCO3各 1g的溶剂中）10mg·kg-1·d-1，对照组仅给予药品溶剂。测定内膜面积时于损伤后10d处死大鼠，测定其他项目时分别于损伤后2、3、5d处死大鼠，每时点均处死5只大鼠。

1.2 测定弹性蛋白酶ⅢB水平

用PBS经心脏穿刺进行压力为110mmHg的血管灌注，然后用甲醇-Carnoy液灌流固定。取损伤动脉并切成长2mm的5段。将标本制成石蜡切片［5］，进行HE和Elastica-Masson三染色。再用多克隆抗大鼠胰腺弹性蛋白酶抗体进行免疫组织化学染色。采用抗链球菌卵白素-生物素-过氧化物酶复合体法（ABC法），常规DAB发色，亮绿或苏木精染核。

1.3 弹性蛋白酶ⅡmRNA原位杂交

用4%多聚甲醛PBS灌流固定，取损伤动脉并切成长2mm的5段。将标本制成石蜡切片，以标记地高辛的大鼠胰腺丝氨酸弹性蛋白酶ⅡcDNA为探针（Boehringer公司）［6］进行杂交［7］，然后用羊抗地高辛-碱性磷酸酶复合物进行免疫组织化学染色。NBT/BCIP显色，亮绿染核。

1.4 测定弹性蛋白酶和明胶酶活性［8］

取损伤动脉，用冰冷肝素化PBS灌流冲净，剥离外膜后切成1mm×1mm大小标本并称质量。将标本置于浓度为50mmol/L的胰腺弹性蛋白酶底物中，孵育、离心并取上清液。用分光光度计测量波长为405nm的对硝基苯胺（p-nitroaniline，p-NA）的吸光度。作出各p-NA浓度对应的吸光度值的相对标准线，以 p-NA（μmol/L）/血管湿重（mg）表示弹性蛋白酶活性。

用4%多聚甲醛PBS灌流固定，取损伤动脉并切成长4mm的4段。标本依次在5%、10%和15%的4℃蔗糖PBS中各浸泡15min后包埋，制成7～8μm厚冰冻切片。切片置于富含明胶的放射自显影乳剂载玻片上。切片湿盒中37℃温箱孵育后，再4℃孵育15h，常规显影。

1.5 测定内膜面积

取损伤动脉并切成长2mm的5段。用配备摄像机的显微镜（VM 30，Olympus）将血管横断面图像输入计算机并用软件NIH Image 1.61求出内膜面积。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 替莫普利对大鼠损伤动脉弹性蛋白酶ⅢB、弹性蛋白酶ⅡmRNA表达、弹性蛋白酶活性的影响

动脉损伤后2、3、5d实验组VSMC弹性蛋白酶ⅢB免疫组织化学染色阳性细胞率明显小于对照组（P＜0.01﹚（表1），免疫组织化学染色明显弱于对照组（图1）。实验组VSMC弹性蛋白酶ⅡmRNA阳性细胞率明显小于对照组（P＜0.01﹚（表1），免疫组织化学染色明显弱于对照组（图2）。实验组弹性蛋白酶活性明显弱于对照组（P＜0.01﹚（表1）。动脉损伤后3d实验组明胶酶活性几乎全部被抑制，对照组出现全层连续片状透光区（图3）。

表1大鼠损伤动脉V S MC的弹性蛋白酶ⅢB、弹性蛋白酶ⅡmR N A阳性细胞率和弹性蛋白酶活性T a b.1P e r c e n t a g e s o f V S MC s p o s i t i v e f o r e l a s t a s eⅢBa n d e l a s t a s eⅡmR N Aa n d e l a s t a s e a c t i v i t y a t d i f f e r e n t t i me p o i n t s a f t e r a r t e r y i n j u r y Group ElastaseⅢB ElastaseⅡmRNA Elastase activity Experimental Control Day 29.68±2.971)25.92±5.17Day 312.82±4.831)28.65±8.74Day 510.06±3.121)35.66±7.73Day 29.31±8.971)27.82±6.851)P<0.05vs control group.Day 330.46±7.881)45.84±8.74Day 530.21±8.741)54.45±10.24Day 20.46±0.081)0.77±0.21Day 30.51±0.101)0.61±0.09Day 50.42±0.111)0.79±0.31

2.2 替莫普利对内膜面积的影响

实验组10d的内膜面积为（8811.5±5918.7）μm2，明显小于对照组（129382.7±50977.3）μm2（P＜0.01﹚。

3 讨论

再狭窄是动脉对损伤的修复反应，主要由早期的内膜肥厚和后期的血管重构形成。内膜肥厚的本质是中膜增殖的VSMC向内膜的迁移，就增殖与迁移的关系而言，增殖是迁移的前提，只有增殖到一定的密度的VSMC才能迁移。弹性蛋白是大动脉中含量最丰富的蛋白质，弹性蛋白酶在VSMC摆脱与ECM的紧密连接、溶解穿过内弹力板而迁移和与ECM相关的血管重构中均有重要的意义。

VSMC通过弹性结合蛋白与弹性纤维结合，通过整合素与ECM中的基膜、胶原、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白结合。弹性蛋白酶能够降解弹性纤维、Ⅳ型胶原、纤维黏连蛋白、层黏连蛋白和蛋白聚糖，使间质的弹性纤维及胶原纤维显著减少［9］。损伤动脉的VSMC与其周围弹性纤维的连接减少到1/10则无迁徙的VSMC。损伤通过细胞内信号转导可引起许多原癌基因的表达和细胞因子的生成，从而使VSMC增殖和凋亡的平衡被打破。动脉损伤后弹性蛋白酶的出现有可能是内皮剥脱后血清因素渗透至中膜直接刺激VSMC产生，但更有可能是损伤导致VSMC产生了促分裂活性更强的血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）而产生。纤维蛋白溶解酶释放出与ECM结合的碱性成纤维细胞生长因子，刺激周围的平滑肌细胞产生PDGF。

PDGF主要与VSMC增殖有关，而弹性蛋白酶主要与迁移有关。迁移细胞见核分裂像，富含粗面内质网和线粒体，表现为合成型细胞的特点。PDGF促进VSMC转化为合成型的增殖性细胞，合成与分泌弹性蛋白酶实现迁移。

ACEI类药物替莫普利能够将血管紧张素（angiotensin，Ang）Ⅰ转化为 AngⅡ［10，11］，AngⅡ可诱导VSMC产生PDGF、成纤维细胞生长因子和转化生长因子，从而导致VSMC增殖和迁移。另外激肽受体拮抗剂Hoe140可显著降低ACEI对再狭窄的抑制提示ACE还是激肽和缓激肽的激肽降解酶。ACEI抑制血浆和血管壁内的ACE、激肽和缓激肽降解酶使激肽和缓激肽水平升高，从而激活血管壁内的一氧化氮合成酶使一氧化氮水平增高，一氧化氮再通过升高环鸟苷酸水平而抑制VSMC增生。以上说明ACEI的作用是通过降低AngⅡ的产生和提高激肽和缓激肽水平两个途径发挥的。

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（编辑陈 姜，英文编辑陈 姜）

Effect of Temocapril on the Elastase in Rat Vascular Smooth Muscle Cell

SUN Juan，SHU Qiang，LING Guang-lie
（Department of Regional Anatomy，The First Hospitial，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effect of temocapril on the level，expression，and activity of elastase in vascular smooth muscle cells（VSMC）in balloon-injured rat artery.MethodsThe rat model of arterial stenosis induced by artery injury was established.The Wistar rats were treated with temocapril hydrochloride （experimental group）and medicine solution （control group），respectively.On days 2，3，and 5after the artery injury，the percentages of cells positive for elastaseⅢB and elastaseⅡ mRNA and the activity of elastase were determined in both groups.Collagenase in situ zymography was performed on day 3after the artery injury.The intimal area was measured 10days after the artery injury.ResultsCompared with the control group，the percentages of cells positive for elastaseⅢB and elastaseⅡ mRNA，the activity of elastase，the level of typeⅣ collagenase，and the intimal area significantly decreased in the experimental group.ConclusionTemocapril may inhibit intimal hypertrophy by inhibiting the level，expression，and activity of elastase and the level of collagenase in VSMCs in the injured artery.

restenosis；angiotensin converting enzyme inhibitor；vascular smooth muscle cell；elastase

R453.9

A

0258-4646（2011）01-0042-03

孙娟（1976-），女，主治医师，硕士.E-mail：sunjuan163163163@163.com

2010-04-14