谭斐，吴晓黎，景良，李桂晨，赵琛，郭阳

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110004）

硫酸软骨素蛋白多糖抑制神经元轴突生长体外生物模型的建立

谭斐，吴晓黎，景良，李桂晨，赵琛，郭阳

（中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110004）

目的利用硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG）的生物特性建立抑制神经元生长和轴突再生的体外生物模型。方法 将不同浓度CSPG与无生物毒性的德克萨斯红荧光染料混合，取5μl滴在培养板的中心部位，形成边界清楚的红色圆形斑点，称CSPG圆斑（CSPG SPOT）。将神经母细胞瘤SY5Y细胞和小鼠小脑颗粒细胞（CGNs）铺在含有CSPG SPOT的培养板中，48h后观察细胞的生长情况。结果 含有1μg/ml和3μg/ml CSPG的SPOT分别使CGNs和神经母细胞瘤SY5Y细胞停止生长、死亡，没有发现细胞的轴突延伸到SPOT上生长。高浓度的CSPG可渗透到SPOT周围区域，使CSPG SPOT周围区域的细胞生长和轴突再生受到抑制。结论该模型可以在体外模拟胶质细胞分泌的CSPG对神经细胞生长的抑制作用，对研究中枢神经系统损伤后神经元的生长和轴突的再生具有广泛的应用前景。

硫酸软骨素蛋白多糖；细胞生长；轴突延伸；小脑颗粒细胞；神经母细胞瘤细胞

成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）轴突损伤后无法再生，可能与CNS髓鞘脂和胶质瘢痕的抑制作用有关。在CNS损伤后，胶质细胞反应性活化、增殖，形成胶质瘢痕。胶质瘢痕及其分泌的以硫酸软骨素蛋白多糖 （chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGS）为主的大量抑制因子，严重阻碍轴突再生［1］。因此改善CNS损伤后的微环境可能有利于细胞的生长和轴突的再生，从而促进CNS损伤后神经组织及其功能的恢复。CSPGs代表一组复杂的细胞外基质大分子，在哺乳动物的CNS中含量丰富，是由核心蛋白和含有硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）二糖重复单位的糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）组成的蛋白多糖，以跨膜蛋白和分泌蛋白两种形式存在［2］。研究发现，CNS损伤后病变周围区域CSPGs表达水平升高［3，4］，而 CNS 受损后神经元轴突再生受到抑制与CSPGs的高表达有关［5，6］。目前，对CSPGs引起的神经元轴突抑制机理的研究以及如何阻断这种抑制作用已成为神经科学研究的热门课题，这就使得建立有效的体外研究模型成为迫切的需要。本文详细描述CSPGs圆形斑点的特点和使用，并探讨这一体外生物模型的适用性。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

本研究使用具有神经元特性的神经母细胞瘤细胞系—SY5Y细胞和体外培养的原代神经元-新生小鼠小脑颗粒细胞神经元（cerebellar granule neurons，CGNs）进行模型的研究。SY5Y细胞在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 RMPI 1640（Sigma-Aldrich公司）培养液中于37℃孵育箱中培养。CGNs首先从活体小鼠中获得，然后在Neurobasal medium A（Invitrogen-GIBCO公司）培养液中于37℃孵育箱中培养。

1.2 小鼠CGNs的分离与培养

1.2.1 培养板的处理：24孔塑料培养板，每个孔用无菌镊放入一个载玻片，然后每个孔再加入50μg/ml的多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）200μl，使载玻片浸入PLL液体中。静置120min后用纯蒸馏水冲洗2次，在通风厨中风干后用锡纸包好放4℃冰箱待用。

1.2.2 细胞的分离与培养：小鼠（C57BL/6）CGNs的培养使用以 Levi［7］和 Romero［8］培养方法为基础的改进方法［9］。取出生后7d的小鼠、断头。术者左手持镊子固定小鼠头部，右手持剪子从小鼠头部两侧迅速剪开皮肤和颅骨，然后用弯剪向上掀起小鼠后颅骨，暴露出小脑和部分大脑，用镊子轻轻剥离整个小脑，每2个小脑放入1个35mm的培养皿中，每个培养皿事先盛有2ml冰预冷的Hank’s液。在解剖显微镜下仔细分离掉小脑上的软脑膜和血管。重复上述步骤，直到收集够实验所用的小脑。用镊子把小脑转移到盛有4ml Hank’s液的培养皿中，再用解剖剪剪碎小脑，加4ml 0.25%Trypsin，轻轻地摇匀，并在37℃水浴箱中孵育10min。之后再加含有10%FBS的培养液5～6ml终止Trypsin的消化作用。转入15ml细胞培养管，500r/min，离心5min。彻底倾倒上清后加入5ml含有5%DNaseⅠ（1∶20，0.25ml DNaseⅠ 溶在 4.75ml DMEM 液中）的DMEM。用力摇匀并反复吸打使之变成均匀一致的混浊液后经过40μm筛网过滤。500r/min离心过滤液5min。倾倒上清后加入Neurobasal medium A（Invitrogen）培养液（B27+Glutamin+25mmol/L KCL+1%Pen-Strep）2～3ml，用移液器轻轻地吸放，使细胞溶解于培养液中，调整细胞的密度为（3～6）×104/ml，接种入24孔板中。再转入温度为37℃，含5%CO2的孵箱中培养。

1.3 CSPG SPOT的制备

将不同量的CSPG（Sigma公司）与无毒的德克萨斯红荧光染料（Invitrogen公司）混合配制成不同浓度的 CSPG 混合液，分别是 0，0.5，1.0，3.0，5.0和10μg/ml。取含有不同浓度的 CSPG 混合液 5μl分别滴到事先用PLL覆盖好的培养板底部的载玻片上，5μl的小液滴形成一个红色的略带突起的圆形斑块，红色是德克萨斯红的颜色。室温下静置2h，注意保湿，防止5μl的液滴蒸发。然后用1×PBS液冲洗2遍，风干后备用。这样，在培养板底部载玻片的中心部位有一边缘整齐的红色圆斑（SPOT），沿着SPOT的边缘形成了一个CSPG/PLL界面。界面内是圆形斑块，均匀地分布着含有一定浓度的CSPG，界面的外边是PLL德克萨斯红的颜色使SPOT与周围区域非常容易在荧光显微镜下分开。铺入细胞后，虽然细胞在同一个培养皿中，但处于不同位置的细胞生长环境不一样，便于观察对比。将准备好的SY5Y细胞和制备好的CGNs0.5ml移到含有CSPGSPOT的培养板底部的载玻片上，于37℃孵育箱中培养24h，在显微镜下观察细胞轴突生长情况并拍摄照片。

1.4 细胞免疫荧光染色

（1）细胞准备：将神经细胞接种到预先放置24张6mm×22mm盖玻片的24孔培养板中，盖玻片上有事先制备好的CSPG SPOT。待细胞生长成熟和贴壁后，取出盖玻片，用 1×PBS（0.01mol/L，pH7.4）洗 3次。（2）法固定细胞：用4%多聚甲醛固定液（paraformaldehyde，PFA） 室温下固定 15min，1×PBS洗3次，吸净PBS。（3）通透：用0.1%渗透液Triton-100室温下孵育15min，1×PBS洗3次，每次5min，吸净PBS。（4）封闭：加入封闭液（5%BSA，以1×PBS稀释）室温封闭1h，吸去封闭液。（5）滴加适当稀释的特异性抗体：一抗：单克隆β III-tubulin抗体（Sigma公司），使用封闭液1∶100稀释。在室温下孵育2h。1×PBS洗3次。（6）滴加适当稀释的荧光素标记抗体，2抗：羊抗鼠-FITC IgG 1∶100（Jackson Immuno Rsearch）在室温下置于湿盒内孵育45min，1×PBS洗3次。（7）用含有细胞核染色剂DAPI的封片液封片（Vector Laboratories，Inc.），自然晾干后在显微镜下观察。

2 结果

2.1 荧光显微镜下SPOT形态及CGNs生长

制备成的CSPG SPOT肉眼所见是淡红色圆斑，大小1mm左右。由于SPOT含有德克萨斯荧光染料，在荧光显微镜下非常容易发现和辨认，而视野的其他部分由于不发光，不能被看到。图1A和B分别为CSPG SPOT在低倍镜下所见。图1C是在高倍镜下看到的CGNs经β III-tubulin染色后的形态以及与SPOT的关系，由于该SPOT没有混合CSPG，CGNs可以在SPOT上生长，细胞的轴突也可以自由穿过CSPG/PLL界面任意地爬行生长，轴突生长方向不受限制。

2.2 显微镜下无染色细胞在CSPG SPOT上生长的观察方法。

图2A为荧光显微镜下所摄的图片，红色部分为SPOT，这是镜下所见SPOT的实际染色。图2B为在同一视野固定不动的情况下，转换为光镜下所摄的图片。图2C为图1A和B经photoshop叠加形成，叠加后SPOT为浅绿色。以下所示各图均是同一视野下光镜下和荧光下所拍图片的叠加，SPOT均为浅绿色。分析叠加后的图片，可以在同一张图片上即可看到SPOT又可看到细胞生长情况。可以准确，清楚地研究SPOT上细胞生长情况以及SPOT抑制细胞生长及轴突延伸情况。

2.3 CSPG对SY5Y细胞生长的影响

SY5Y细胞是具有神经元特性的神经母细胞瘤细胞系，首先研究不同浓度CSPG对SY5Y细胞生长的影响。如图3所见，在没有CSPG（0μg/ml）的条件下SY5Y细胞在整个培养板的底部均匀生长（图3A）。在添加CSPG的培养皿中，每个条件种植相同数量的细胞，虽然含0.5μg/ml和1.0μg/ml CSPG SPOT的培养皿中的细胞密度变得较稀疏，但细胞的生长仍比较健康（图3B，C）。但当CSPG浓度增加至3μg/ml时，可见明显的以CSPG SPOT边缘为界限的CSPG SPOT区域内细胞生长抑制（图3D），没有细胞生长。但SPOT周围区域的细胞生长正常，细胞突起也不向SPOT内伸展。随着CSPG浓度的逐渐升高，CSPG周边部的细胞也受影响，细胞远离CSPG SPOT生长（图4E，F）。

2.4 CSPG对小鼠CGNs生长的影响

CSPG对原代神经元小鼠CGNs的影响与对SY5Y细胞生长的影响相似，只是CSPG抑制细胞生长所需的浓度有所不同。如图4所示，在没有CSPG（0μg/ml）的条件下，CGNs在整个培养板的底部均匀生长（图4A），0.5μg/ml CSPG使得CSPG SPOT区域的细胞生长密度略有降低（图4B），当CSPG浓度升为1.0μg/ml时，可见明显的细胞生长停止的边界：沿着CSPG SPOT的边缘，CSPT SPOT内细胞不生长，CSPG SOPT外细胞生长，但细胞突起不向SPOT内伸展（图4C）。但当CSPG浓度升至3.0μg/ml时（图4D），CSPT SPOT外缘周围区域细胞生长也受到限制，这种限制在5.0和10.0μg/ml的浓度时更明显（图4E，F）。

3 讨论

中枢神经系统受到损伤后会产生反应性胶质增生或胶质瘢痕形成。在胶质瘢痕的形成过程中，胶质细胞分泌一些抑制性分子，主要包括一些CSPGs，这些抑制分子在损伤区的堆积是抑制轴突生长的重要因素［10］。为了研究CSPG阻断神经元轴突生长的机制，我们制作CSPG SPOT模拟体内神经元损伤后病变区CSPG升高的病理生理环境。首先在细胞培养皿的底部覆盖一层PLL，PLL是由多种细胞分泌的存在于细胞基质中对细胞起着支持、保护、连结和营养作用的一种物质，这个过程相当于模拟神经细胞正常生存的基质环境。然后在其上加入5μl含有CSPG的液体，这个小液滴由于重力和张力作用形成大约直径1mm的圆形区域，这个区域相当于神经损伤病变区，含有CSPG。由于CSPG液体本身没有颜色，即使在显微镜下也不能确定这个模拟神经病变区的位置所在。所以我们在配制CSPG的液体中加入无生物毒性的荧光染料。这样我们就可以在荧光显微镜下区分病变区和非病变区，研究神经生长与CSPG抑制作用之间的关系。CSPG和PLL的交界区，我们称为CSPG/PLL界面，界面的一边主要含有CSPG，界面的另一边仅含有PLL。细胞的轴突如果能够穿过这一区域，细胞就可以在CSPG上生长，即在病损区生长，是判定CSPG浓度是否抑制细胞生长的分界线。

我们发现在最低的4倍物镜下可以看到整个5μl的液滴形成的SPOT，但无法观察细胞生长情况。20倍物镜下可以看到细胞生长被抑制的起止点，但无法细致地观察细胞生长情况。在63倍的物镜下，细胞体以及细胞轴突生长和生长方向非常清楚，有利于研究病变区细胞形态变化和生长情况。

肿瘤细胞能够自给自足地获得生长信号，具有顽强的生长和分裂的能力。而原代神经元培养所需的条件较高，对周围环境改变极其敏感。所以我们分别选择具有神经元特性的神经母细胞瘤细胞系—SY5Y和CGNs神经元，研究抑制细胞生长的模型对他们的影响及发现抑制这两种细胞生长的最适合浓度。我们发现引起细胞生长抑制的CSPG浓度在不同细胞中不同，如在SY5Y细胞中需要3μg/ml达到明显的生长抑制，而在CGNs中仅需要1μg/ml。同时我们观察到，小鼠CGNs对CSPG的变化更敏感，3μg/ml CSPG浓度可使SPOT周围区域的细胞生长受到抑制，而在SY5Y细胞，直到5μg/ml的浓度，SPOT周围区域细胞生长才开始受到抑制，10μg/ml对SPOT周围的抑制更加明显。这一结果提示，在具体的实验研究中，应根据所使用的细胞种类的不同选择相应的适宜浓度，甚至实验目的不同，CSPG应使用的浓度也会不同。以本实验结果为例，如果研究某种治疗方法对轴突生长的促进作用，那么对于小鼠CGNs我们选择1μg/ml，对SY5Y细胞我们选择3μg/ml。这两个浓度引起的细胞突起生长抑制刚好是沿着CSPG SPOT边缘，而不累及SPOT周围区域。如果使用药物抵消CSPG的作用，细胞可能重新在SPOT上生长，轴突可能又延伸至CSPG SPOT内，我们将在今后的研究中深入探讨。

虽然CSPG引起神经元突起生长抑制已比较肯定，但CSPG的作用机理还不明确，最近有报道Rho/ROCK通路可能参与了CSPGs的信号转导［11］，目前Rho/ROCK通路被认为是调节与突起生长有关的骨架肌动蛋白的一条重要信号转导通路，许多轴突生长抑制分子都是通过激活该通路发挥效应的。这提示在损伤局部直接降解CSPGs，或者抑制与CSPGs有关的细胞内信号转导，对于CNS损伤后的轴突再生都可能有促进作用。利用本研究方法建立的模型，可以在原位通过免疫染色的方法，观察细胞与CSPG接触后细胞内信号通路的变化，同时可以研究在针对CSPG给予相应的处理条件后神经元轴突的生长变化情况。所以这一模型对研究CNS损伤后神经元轴突的生长和神经元的再生具有广泛的应用前景。

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（编辑裘孝琦，英文编辑陈 姜）

An in vitro Model of Chondroitin Sulfate Proteoglycan-induced Axon Outgrowth Inhibition

TAN Fei，WU Xiao-li，JING Liang，LI Gui-chen，ZHAO Chen，GUO Yang
（Department of Neurology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo establish an in vitro model to study the inhibitory effect of chondroitin sulfate proteoglycan（CSPG）on neuronal growth and axonal regeneration.MethodsDifferent concentrations of CSPG were mixed with Texas-red Dye which has no biological toxicity，and 5μl of the mixture was dropped onto the center of the bottom of culture plates to form red round spots，which was called CSPG spots.SY5Y neuroblastoma cells or cerebellar granule neuron （CGN）from mice were seeded on the plates and cultured for 48hours.The cell growth and axon extension were observed under microscope.ResultsIn CSPG spots containing 1and 3μg/ml of CSPG，the growth of CGNs and SY5Y neuroblastoma cells were inhibited，and cell death occurred in the spot areas.No axon extension was found in cells outside the CSPG spots.High concentration of CSPG in the spots inhibited the growth of cells around CSPG spots.ConclusionThis model mimics the CSGP-induced axon outgrowth inhibition，which can be used to study the neuronal growth and axonal regeneration after central nervous system injury.

chondroitin sulfate proteoglycan；cell growth；axon extension；cerebellar granule neuron；neuroblastoma cell

R338.1

A

0258-4646（2011）01-0004-05

辽宁省科技厅社发基金资助项目（2009225010-12）

谭斐（1966-），男，副教授，硕士.E-mail：tanf@sj-hospital.org

2010-10-05