谢 放，田 伟，朱子雄

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070）

草甘膦（glyphosate）是目前世界上使用量最大的除草剂，化学名为N-膦酸甲基甘氨酸。草甘膦在进入植物体内以后，会和磷酸烯醇式丙酮酸竞争性地与5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）结合，使EPSPS永久地失去活性。EPSPS主要存在于细菌、真菌、藻类和高等植物体内,它是生物合成芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）过程中一个重要的酶[1]。

随着杂草对于草甘膦耐受性的增强，我们需要不断的提高使用草甘膦的次数以及浓度，一旦超过作物的耐受程度，则作物也会随之受害，进而造成经济损失。目前市场上的草甘膦抗性菌株的基因来源主要是对于草甘膦耐受性好的微生物中，因此，本研究从生产草甘膦工厂的污水处理池边的土壤中，分离出抗性菌株，并鉴定得到草甘膦抗性基因，以期获得抗更高浓度转基因作物提供研究材料。

1 材料与方法

1.1 土样

江苏辉丰公司污水处理池边的土壤。

1.2 培养基

1.2.1 LB培养基 酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加水至 1 L，pH 7.0，121℃灭菌 21 min。1.2.2 基础培养基[2]KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.04 g，加水至1 L，pH 值 7.0，过滤灭菌。

1.2.3 鉴定培养基 见文献[3]

1.3 主要药品

95%草甘膦原药,其余药品为国产分析纯。引物[4]：F 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，R 5′-T ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.4 方法

1.4.1 降解菌的富集与筛选 称取土壤5 g，置于100 mL基础培养基中（草甘膦浓度为200 mg/L），120 r/min、30℃摇床培养7 d。后以2%的接种量进行连续转接，每次转接草甘膦的浓度递增为400、600、800和1 000 mg/L。最后在LB培养基平板中进行划线分离培养，连续数次，得到单菌落。

1.4.2 菌种在含有草甘膦基础培养基中生长曲线的测定 将活化后的菌液以2%的接种量接种到800 mg/L的草甘膦基础培养基中，120 r/min，30℃摇床培养，每隔24 h进行OD600值的测量。……