任燕冬 宋宏杉 陈巧云 张 宁▲

（1.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江佳木斯 154007；2.大庆油田总医院集团龙南医院，黑龙江大庆 163453）

人体皮肤颜色各不相同，与种族、年龄、性别、外界环境以及某些疾病等因素密切相关，其中黑素细胞产生的黑素是决定皮肤颜色的主要因素[1]，酪氨酸酶是黑素生物合成途径中的主要限速酶，该酶活性大小决定着黑素形成的数量。杏仁含有丰富的脂肪油，具有使皮肤白嫩柔细、促进皮肤光洁红润的作用，是古今公认的美容佳品。本实验利用超临界CO2技术萃取杏仁油，主要研究杏仁油对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖及黑素合成的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器

BCM-10004型超净工作台（苏净集团安泰公司制造）；OLYMPUS IX71倒置显微镜；HF-90 CO2培养箱；8-5K台式低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；MK3型酶标仪（热电上海仪器有限公司）。

1.2 试剂

MEM培养基购于Gibco公司；胰蛋白、MTT购于Billab公司；PBS购于北京中杉金桥有限公司；L-dopa、TritonX-100、DMSO购于Sigma公司；小鼠黑色素瘤细胞B16购于中科院上海细胞所。

1.3 方法

1.3.1 杏仁油的提取 利用超临界CO2技术从杏仁中萃取杏仁油，备用。

1.3.2 细胞培养[2]选择对数生长期的同一代细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，用含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液传代，置于CO2培养箱37℃、5% CO2饱和湿度环境中进行培养。每一次实验取自同一传代细胞，初始接种细胞浓度为5000个/cm2左右。细胞接种24h后，弃上清液，添加待测药物。在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养，每一浓度设6个复孔，对照组不加药物代之同量维持液，培养3d，1.5d后更换药液1次。

1.3.3 细胞增殖率的测定 药物作用72h后，每孔加入5g/L MTT溶液10μL，4h后弃上清液，每孔加入DMSO 100 μL，振荡10min左右，在酶标仪上检测各孔吸光度值，波长为490nm。细胞增殖率＝［（待筛物各浓度平均吸光度值－空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值－空白组平均吸光度值）］×100%。

1.3.4 细胞内酪氨酸酶活性测定[3]采用多巴氧化法对酪氨酸酶活性进行测定。将作用时间已到的细胞弃上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）荡洗2次，每孔加1% TritonX-100溶液100 μ L，0℃振荡10min，30min后升温至37℃，加入0.1% L-DOPA溶液10 μ L，孵育30min后在490nm波长处测吸收度（A）。酪氨酸酶活性影响率＝［（待筛物组平均吸光度－空白组平均吸光度）/（对照组平均吸光度－空白组平均吸光度）］×100%。

1.3.5 细胞内黑色素含量的测定[4]将小鼠黑色素细胞B16以1×105个/mL的密度接种于6孔板，每孔3mL，孵育24h后，弃上清液，添加待测药物，药物作用3d后，弃上清液，PBS洗涤，每孔加入0.5mL胰酶消化细胞3min，加2mL维持液终止消化，分别计数每组细胞。细胞悬液离心，弃上清，沉淀中加入1mol/L NaOH（含10% DMSO）溶液，80℃下孵育30min，加入双蒸水将NaOH稀释成0.2mol/L，混匀后分别取100μL置96孔板中，475nm处测吸光度。黑色素合成抑制率＝［（待筛物组吸光度/细胞数的平均值）/（对照组吸光度/细胞数的平均值）］×100%。

1.4 统计学处理

使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所测数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，方差齐性用t检验，多组间比较采用LSD检验。

2 结果

2.1 杏仁油对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖的影响

MTT实验结果显示杏仁油浓度在0.1～100μg/mL对小鼠黑色素瘤细胞B16细胞增殖无影响（P＞0.05），见表1。

2.2 杏仁油对小鼠黑色素瘤细胞B16酪氨酸酶活性的影响

杏仁油浓度在0.1～100 μg/mL对小鼠黑色素瘤细胞B16中酪氨酸酶活性具有显著性抑制作用（P＜0.05），呈浓度依赖性抑制，且均见表2。

2.3 杏仁油对小鼠黑色素瘤细胞B16黑素含量的影响

杏仁油浓度在0.1～100 μg/mL对小鼠黑色素瘤细胞B16中黑素含量具有显著性抑制作用（P＜0.05），呈浓度依赖性抑制，且均见表3。

3 讨论

目前在人群中广泛存在黄褐斑、雀斑、老年斑、皮肤晦暗、发黄等皮肤色素沉着等损美性疾病，严重影响着人们的身心健康。我国天然药物资源丰富，大量天然药物在历史记载中具有调节色素沉着的作用，杏仁即是在美容、保健、化妆品行业及医疗机构中应用比较广泛、疗效较好的天然药物，但目前有关杏仁美容作用的现代科学实验研究比较少，机制不明。

本研究利用小鼠黑色素瘤细胞B16研究杏仁油对于细胞内黑素生成的影响，从细胞生物学的角度探讨其发挥美容作用的机制，发现其可在不杀伤细胞的浓度范围内抑制黑素生成，并呈剂量依赖性，从而为杏仁油在治疗色素沉着性皮肤病上的应用提供理论基础。

表1 杏仁油对小鼠黑色素瘤细胞B 16增殖的影响(n=6)

表2 杏仁油对酪氨酸酶活性的影响(n=6)

表3 杏仁油对黑素含量的影响(n=6)

[1] 杨观招，解士海. 龙胆草对人黑素细胞增殖及黑素合成的影响[J]. 热带医学杂志，2009，9（8）：884-886.

[2] 司徒镇强，吴军正. 细胞培养（修订版）[M]. 北京：世界图书出版社，2004：35-42，79-80.

[3] 张春香，尹鸿萍，王旻，等. 几种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性[J]. 中国生化药物杂志，2005，26（2）：72-75.

[4] 张目，严泽民，朱少娟，等. 几种中药的美白作用研究[J]. 香料香精化妆品，2009，37（1）：33-36.