段跃强 李晓楠 曹 东 魏 澍 杨鹏辉 邢 丽 王希良 李培锋

(内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018)

甲型流感病毒是一类可导致高发病率和高死亡率的传染性病毒，甲型 H1N1(A/California/07/2009)流感病毒是爆发于墨西哥和美国的流感大流行的病原体，自爆发后蔓延全球，引起世界的恐慌［1-3］。截至2010年底，全球已有213个国家报道确诊病例17 410例。

流感病毒在雪貂间的传播与人类传播最为相似，因此，目前雪貂被认为是检测流感病毒最理想的动物模型［4-6］。通常情况下，研究人员选择具有代表性的H1N1流感病毒在雪貂间进行传播试验，以评估这些病毒经飞沫传播的可能性，同时也通过接种病毒，来观察雪貂的发病情况［7-9］。

本实验应用减毒A/California/07/2009ca病毒及BJ501病毒免疫雪貂，通过对雪貂的各生理指标、各器官的病毒载量的检测，来评价减毒A/California/07/2009ca病毒的弱毒性及免疫保护性。

1 材料与方法

1.1细胞、鸡胚、毒株及动物 MDCK细胞，购自ATCC公司;减毒A/California/07/2009ca流感病毒本室拯救;野毒株BJ501由中国疾病预防控制中心提供;雪貂购自江苏无锡。

1.2主要试剂 DMEM、TPCK胰酶购自Sigma;胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司;96孔细胞培养板购自CORNING公司。

1.3TCID50的测定 用MDCK细胞铺96孔板，每孔4×104个细胞，待长成单层后，病毒按101、102、103……倍数稀释。每孔200 μl，稀释液为MEM 无血清培养基(含TPCK胰酶1 μg/ml)，5天后电镜下观察结果，用Reed-Muench法计算TCID50，TCID50=高于50%感染病毒稀释度的对数+(高于50%感染百分数-50)/(高于50%感染百分数-低于50%感染百分数)。

1.4A/California/07/2009ca、BJ501病毒的毒力研究 10～12周雌性雪貂每组3只，共2组，分别滴鼻免疫A/California/07/2009ca、BJ501病毒，每只免疫107TCID50/200 μl，连续14天观察雪貂的死亡率、体重、精神状态，并在1、2、3、4、5、7 天时应用咽拭子取鼻腔病毒［应用无血清 MEM(50 μg/ml庆大霉素)洗脱］，过滤;应用96孔细胞培养板检测鼻腔中病毒的TCID50。