廖国周，王桂瑛，曹锦轩，程志斌

1(云南农业大学食品科技学院，云南 昆明，650201)2(云南农业职业技术学院畜牧兽医系，云南昆明，650212)3(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波，315211)4(云南农业大学动物科技学院，云南昆明，650201)

生物胺是游离氨基酸在肌肉内源酶和微生物产生的外源酶催化作用下发生脱羧反应产生的一类低分子量有机碱，主要包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质［1］。适量的生物胺对人体健康有益，但当机体摄入高浓度的生物胺后，会产生一系列应激反应，引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等不良症状，严重情况下可引起大脑出血，甚至死亡［2］。由于其具有潜在的毒性，目前对食品中生物胺的研究已成为热点。

宣威火腿是云南省传统名特优产品，2001年获得国家原产地域保护，它是由在原产地域内饲养的含有乌金猪血统的鲜猪后腿在原产地域经过修割定形、腌制、堆码翻压、洗晒整形、上挂风干、发酵制作而成［3］。长时间的腌制加工和发酵成熟过程使肌肉蛋白质和脂肪发生复杂的生物化学变化，形成干腌火腿的特征风味，同时也可能形成生物胺等副产物［4］。本研究旨在通过柱前衍生-HPLC方法测定宣威火腿中生物胺的种类与含量，为进一步评价宣威火腿的安全性提供基本依据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

供试的成品宣威火腿购于昆明当地超市。样品采集后于－20℃贮存待用。

1.2 主要仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，配置四元泵、真空在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、Agilent化学工作站，美国 Agilent公司;色谱柱:ZORBAX XDB－C18(4.6 mm ×250mm，5μm)，美国 Agilent公司;Allegra 64R冷冻离心机，美国Beckman公司;Ultra-Turrax T 25 basic分散器，德国IKA公司;超纯水仪，美国Millipole公司。

1.3 试剂

色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺标准品与丹磺酰氯均购自Sigma公司;乙腈、丙酮均为色谱纯;氨水、高氯酸、NaOH、NaHCO3等均为分析纯。

1.4 测定方法

1.4.1 样品前处理

取5 g宣威火腿样品加入20 mL的0.4 mol/L高氯酸，以分散器彻底匀浆后在冷冻离心机中(4℃，3 000 r/min)离心10 min，收集上清液，沉淀物按上述方法再提取1次。将2次收集的上清液用0.4 mol/L高氯酸定容至50 mL。取1 mL定容后的样品溶液，加入200 μL的2 mol/L NaOH，然后加入300 μL的饱和NaHCO3溶液进行缓冲，接着加入2 mL的丹磺酰氯衍生剂(浓度为10 mg/mL，溶剂为丙酮)，并在室温黑暗中反应处理30 min，反应结束后加入100 μL的氨水以终止反应。最后以乙腈定容至5 mL。经衍生处理的样品液用0.45 μm的有机滤膜过滤后即可上机测定。

1.4.2 色谱条件

釆用二元流动相体系:A为水，B为乙腈，其梯度洗脱程序见表1。紫外检测波长为254nm，流速为1 mL/min，进样量为 20 μL，柱温为 40℃。

1.4.3 标准曲线

50 mg各种生物胺标准品分别溶于0.4 mol/L高氯酸中，并定容至50 mL，得1 mg/mL各种生物胺的标准储备液。分别取各种生物胺的标准储备液，用0.4 mol/L高氯酸配制成终浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL 的混合标准溶液。取 1 mL的生物胺标准混合溶液，按上述方法进行衍生化，并上机分析，检测结果以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线。

表1 梯度洗脱程序

1.4.4 回收率、精密度和检测限

准确称取相同的宣威火腿肉样4份，每份5 g，其中3份分别加入质量浓度为500 μg/mL的8种生物胺混合标准液100、500、1000 μL，添加水平分别为1 mg/100 g、5 mg/100 g、10 mg/100 g，另 1 份不加，然后再进行前处理及高效液相色谱分析(n=6)，扣除样品中空白试验生物胺的含量，计算回收率和精密度。根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，本法的检测限定义为产生相应于3倍背景噪音的标准偏差分析信号的浓度值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的回归方程、决定系数及方法的检测限

以标准样品浓度为X，以HPLC测得相应的峰面积为Y绘制标准曲线，得各生物胺标准曲线的回归方程，见表2。结果表明，各标准曲线的决定系数均大于0.99，各组分在0.5～20 μg/mL内线性良好。据检测限定义可知，亚精胺与精胺的检测限为0.05 μg/mL，其余6种生物胺的检测限均为0.1 μg/mL，可以满足定量分析的需要。

表2 标准曲线的回归方程、决定系数及方法的检出限

2.2 方法的回收率与精密度

按回收率方法项操作，得到样品中添加低、中、高3个浓度水平生物胺混合标准液的回收率和精密度，见表3。结果可知，8种生物胺的加标回收率的变异范围为81.58%～95.58%，相对标准偏差为2.48% ～5.85%。表明各浓度水平的加标回收率和精密度均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确性和可靠性。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)

2.3 宣威火腿中生物胺的种类与含量

图1和图2分别为生物胺标准品与宣威火腿样品的紫外检测色谱图。由图1可知，本检测方法能有效地分离鉴定8种生物胺，且各组分峰尖锐、峰形对称，20 min左右生物胺可被全部洗脱。图2显示，在与生物胺标准品相同的保留时间里只出现6个峰，分别为苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亚精胺与精胺。

由表4可知，在宣威火腿样品中并未检测出色胺与组胺，只发现苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亚精胺与精胺6种生物胺，含量在0.37～4.28 mg/100 g，其中精胺含量最高，酪胺次之。目前对于干腌火腿中生物胺的分析报道较少，Wei等［4］在如皋火腿样品中检测出7种生物胺，分别是酪胺、苯乙胺、腐胺、精胺、色胺、尸胺和亚精胺，其中精胺含量最高，达2.65 mg/100 g。Virgili等［5］对意大利干腌火腿中生物胺的测定结果稍有不同，其中酪胺含量最大，其次是精胺，表明加工条件与前体物含量对干腌火腿中生物胺的种类与含量有重要影响。生物胺的毒性取决于个体的特性及其他胺的存在情况，如腐胺本身没有毒性，但可作为酪胺与组胺毒性的增效剂［6］。Eerola 等［7］认为，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、组胺与酪胺)的总量低于20 mg/100 g是发酵肉制品具有较高品质的指标之一。本研究釆用柱前衍生-HPLC方法首次对宣威火腿中生物胺含量进行检测，发现生物胺总量为11.56 mg/100 g，其中血管活性生物胺的含量远低于20 mg/100 g。该结果为进一步研究加工过程中生物胺的消长规律奠定基础，并为评价宣威火腿的安全性提供依据。

图1 生物胺标准品的紫外检测色谱图

图2 宣威火腿中生物胺的紫外检测色谱图

表4 宣威火腿中生物胺的种类与含量(n=3)mg/100 g

［1］ Hernandez J T，Izquierdo P M，et al．Biogenic amine and polyamine contents in meat and meat products［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45，(6):2 098－2 102.

［2］ Bardo'cz S．Polyamines in food and their consequences for food quality and human health［J］．Trends in Food Science and Technology，1995，6(10)“341－346.

［3］ 乔发东．宣威火腿标准化生产与品质改良技术研究［D］．北京:中国农业大学，2004:48－58.

［4］ Wei F S，Xu X L，Zhou G H，et al．Irradiated Chinese Rugao ham Changes in volatile N-nitrosamine，biogenic amine and residual nitrite during ripening and post ripening［J］．Meat Science，2009，81:451－455.

［5］ Virgili R，Saccani G，Gabba L，et al．Change of free amino acids and biogenic amines during extended ageing of I-talian dry-cured ham［J］．LWT，2007，40(5):871 －878.

［6］ Hui J Y，Taylor S L．Inhibition ofin vivohistamine metabolism in rats by foodborne and pharmacologic inibitors of diamine oxidase，histamine N-metyl transferase and monoamino oxidase［J］．Toxicology and Applied Pharmacology，1985，8:241－249.

［7］ Eerola S，Roig-Saguèz A X，Hirvi T K．Biogenic amines in Finnish dry sausages［J］．Journal of Food Safety，1998，18(2):127－138.