刘凯，卢士玲，李开雄

(石河子大学食品学院，新疆石河子，832000)

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，是具有厌氧性的杆状菌，能形成芽孢，芽孢比繁殖体宽，呈梭状，革兰氏染色为阳性［1］。肉毒梭菌被证实能在厌氧环境中生长，即使侵入胃肠道内也不发芽增殖，而是随粪便排出［2］。当在营养丰富，高度厌氧的条件下芽孢即转变为菌体且可产生强烈外毒素-肉毒毒素(Botulinum neurotoxin)［3］。肉毒毒素是1种特殊的蛋白质，性质稳定，毒力比氰化钾毒力高1万多倍，小鼠LD50为1.0ng/kg，对人的致死量为1.0pg/kg，是现今已知化学毒物和细菌毒素中毒性最强的一种［4］。自“911”恐怖袭击事件后，美英等西方国家便把其列为最有可能被使用的生物恐怖剂之一［5］。

据不完全统计，1949～2001年，我国已有20个省、区先后发生肉毒中毒908起，其中新疆718起，占中毒次数的79.07%，全国中毒人数3 903人，其中新疆2 259人，占57.88%［6］。新疆为肉毒毒素中毒高发区，豆制品中肉毒毒素中毒屡见报端，在一定程度上制约了新疆豆制品产业的发展。本实验从豆制品加工厂附近土壤中分离出一株肉毒梭菌，应用病原形态学鉴定、细菌生理生化分析、凝胶电泳成像及16SrDNA测序分析相结合的方法对分离出的肉毒梭菌进行鉴定。为今后豆制品中肉毒梭菌的检测，及控制技术研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 样品与仪器

采集豆制品生产环境附近的土壤样品，其中菜市场20份，豆制品加工厂附近15份，污水沟旁草地15份，食品厂污水淤泥:10份，共计60份。以上样品均采自伊宁市察布查尔县。

细菌DNA试剂盒购自北京诺维森生物科技有限公司，PCR扩增所需引物为3种:通用引物，上游引物为 U968:5’－AACGCG AAG AACCTT AC－3’，下游引物为 L1401:5’-GCGTGTGTACAA GACCC-3’;A上:5＇GTGATACAACCAGATGGTAGTTATAG3＇，A 下:5＇AAAAAACAAGTCCCAATTATTAACTTT3＇;B 上:5＇GAGATGTTTGTGAATATTATGATCCAG3＇，B 下:5＇GTTCATGCATTAATA TCAAGGCTGG3＇。由上海生工生物工程有限公司合成。表1和表2为其反应体系和反应参数。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应参数

1.0 %葡萄糖庖肉培养基:

蛋白胨12 g，牛肉浸液400 mL，酵母浸膏2 g，葡萄糖1.2 g，NaHPO42 g，碎肉渣适量，调节pH为7.4～7.6。

制法:牛肉浸液制法:取新鲜(除脂肪和筋膜)牛肉200 g，加蒸馏水400 mL和1 mol/L NaOH 10 mL，搅拌煮沸15 min，充分冷却，除去表层脂肪，澄清过滤，加水补足至400 mL。将牛肉碎块装于试管，每管约15 mm高。然后加入pH 7.4～7.6的牛肉浸液及其他成分，再于121℃灭菌20 min备用。

卵黄琼脂(EYA)培养基:

胰蛋白胨12 g，蛋白胨8 g，NaCl 2 g，琼脂粉8 g，牛肉浸膏20 g，蒸馏水400 mL，50%蛋黄盐水40 mL。

制法:取新鲜鸡蛋，经75%乙醇浸泡1h后，再于无菌操作下取出卵黄放入量筒，再加入等量无菌生理盐水混匀即得蛋黄盐水，除蛋黄盐水外其余成分混合，加热溶解调节至pH值7.3～7.4，121℃灭菌20 min，冷至60℃加入50%的蛋黄盐水，混匀倾注平板。

发酵培养基:

0.04 %溴甲酚紫水溶液5 mL，蛋白胨4 g，乳糖(葡萄糖或蔗糖或麦芽糖)2 g，蒸馏水200 mL。

制法:将蛋白胨和乳糖(葡萄糖或蔗糖或麦芽糖)溶于水中，校正pH，加入指示剂，115℃高压灭菌15 min。

石蕊牛奶培养基:

10% ～15%脱脂奶粉溶液100 mL，石蕊乙醇液2.5 mL

石蕊乙醇液的制法:8g石蕊在34 mL 40%乙醇中研磨，取上清液，重复操作2次。加40%乙醇到总量为100 mL，并煮沸1 min，取用上清液。上述成分混匀分装试管，每管5～10 mL 115℃灭菌20 min。

明胶培养基:

牛肉浸膏0.6g，蒸馏水200 mL，蛋白胨1 g，明胶24 g。

制法:各成分加入蒸馏水中，浸泡约20 min，随时搅拌，加热溶解，调节至pH 7.5，分装小试管，115℃灭菌20 min。

EL3002电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SW-CJ-超净台，苏州安泰空气技术有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;GMSX-280型压力蒸汽消毒器，北京市永光明医疗仪器厂;GRX20型干热消毒箱，上海精宏实验设备有限公司;电子万用炉，北京市永光明医疗仪器厂;MCL-3型微波炉，微波化学实验仪器厂;DMI4000B置荧光显微镜，Leica公司;BIO-RAD凝胶成像仪，美国BIO-RAD公司;BIO-RAD电泳仪，美国BIO-RAD公司;高速冷冻离心机，德国eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

1.2.1.1 热处理法

样品预处理采用乙醇处理法［7］。以50%乙醇与样品混合作用1h，然后稀释、均质备用。

1.2.2 富集培养

预处理过的样品液吸取0.2 mL，加入到装有20 mL庖肉培养基的试管中，30℃培养5 d，观察细菌生长状况。庖肉培养基用液体石蜡封液面，在使用前于沸水中煮沸15 min后急速冷却，再接种待检物，厌氧培养。

1.2.3 分离培养

于卵黄琼脂培养基(EYA)上进行划线分离，用焦性没食子酸除氧法35℃厌氧培养48h［8］，同时设有氧环境对照。挑选菌落形态与C．botulinum相似的菌落革兰氏染色观察，多次分离，直至得到形态单一的菌落并将类似菌落进行菌株保存。

1.2.4 目标菌的形态观察及生理生化测定

仔细观察细菌在庖肉培养基和EYA培养基上的生长情况和菌落形态，同时通过革兰氏染色观察细菌形态。将在EYA培养基上培养了48 h的细菌接种到不同的生理生化鉴定培养基中，30℃恒温培养48h。参照《伯杰细菌鉴定手册》［9］鉴定反应结果。

1.2.5 目的基因的PCR及16SrDNA V6-V8片段的序列测定

取对数期生长期的新鲜菌液，依细菌DNA试剂盒的操作说明提取基因组DNA。PCR反应体系及参数如表1和表2所示。通用引物扩增目标片段为430bp左右，A型肉毒毒素基因扩增目标片段为980bp左右，B型肉毒毒素基因扩增目标片段为490 bp左右。用BioRad凝胶成像系统照相，通用引物所扩增PCR产物送北京六合华大基因公司测序。

1.2.6 系统发育进化分析

将所测得的16SrRNA基因序列提交到GenBank数据库中，用BLAST进行相关序列的搜索，与Gen-Bank中现有的近缘菌株的序列比较，并从数据库获得相关属、相关种的16SrRNA序列，建立系统发育树［10］。序列用CLUSTAL X program软件对齐，进化距离的计算应用邻接法neighbor-joining method，采用p-distances法和Kimura-2parameter双参数法进行，进化树分支模式的稳定性用MEGA v．3.1软件分析，采用bootstrap法，重复次数为1 000，构建进化树。

2 结果与分析

2.1 目标菌的富集培养和分离纯化结果

2.1.1 目标菌的富集培养结果

60份样品进行富集培养的结果见表3。

表3 富集培养结果

在初步鉴定出的7份50%乙醇处理液的样品庖肉培养管中，牛肉渣部分表面变黑，肉块呈暗红色，培养液黏稠浑浊，产生气泡且伴有恶臭。

其余的样品中有38份培养液黏稠浑浊，但有白色絮状物沉积在管底，肉渣无明显变色。另有15份无明显现象。

培养结果表明，其中7种样品的培养特征与肉毒梭菌的培养特征相似，因此将这7种样品的庖肉培养液接种到分离培养基上进行初步分离。

2.1.2 分离培养结果

将富集培养的7种样品培养液稀释涂布到EYA平板上，分做2份，30℃的恒温培养箱中分别进行有氧和厌氧的培养，培养48 h，观察生长情况及菌落形状，如表4所示。

表4 七种样品EYA平板上的菌落形态

由表4可知，菜市场16号、豆制品加工厂3号、食品厂污水淤泥8号的培养液在EYA平板上生长出的菌落形态与所要筛选的肉毒梭菌的菌落形态相似。

将这3种样品，在EYA平板上反复划线分离，直至镜检观察中未发现杂菌，同时挑取新鲜培养物进行革兰氏染色，显微镜下观察其菌体形态。根据菌体形态观察初步断定食品加工厂3号样品为肉毒梭菌，此待检菌暂命名为JGC－3。

挑取JGC-3菌在EYA平板上的菌落，如图1所示，做革兰氏染色。镜检结果见图2，待检菌JGC-3为粗大杆菌，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽孢为卵圆形，位于次极端，呈网球拍形，革兰氏染色阳性，呈现肉毒梭菌的个体形态特征。

图1 EYA平板上JGC-3菌的菌落形态

图2 JGC-3菌革兰氏染色油镜镜检结果

2.2 生理生化特性

JGC-3菌的生理生化特性与A型肉毒梭菌一致，即可分解葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖，不发酵半乳糖、甘露醇、甘露糖。石蕊牛乳培养基变蓝色，说明该菌株分解酪蛋白，产生碱性物质，使石蕊变蓝色，在培养后期，产生大量气体。明胶液化试验中，明胶最后呈液体状态，属阳性反应，说明JGC-3菌含胶原酶(蛋白分解酶)，将明胶分解为氨基酸，使明胶低于20℃时不再凝固，呈液化状态。

2.3 凝胶电泳与系统进化分析

2.3.1 肉毒毒素基因和16SrDNA V6-V8片段的扩增

由分离菌株JGC-3的电泳图谱(图3)可以看到，采用A型肉毒毒素基因引物所扩增出的条带在目标条带附近，所得到的扩增片段长度与实际相符。采用B型肉毒毒素基因引物为阴性，同时空白样反应也为阴性。

2.3.2 16SrDNA V6-V8的序列系统发育进化分析

图3 分离菌株JGC-3的肉毒毒素基因和16S rDNA V6-V8片段的PCR产物的电泳图谱

将获得的序列在GenBank数据库中进行Blast分析，结果表明菌株 JGC-3的16SrDNA V6-V8序列(GenBank登录号:JN248616)与GenBank基因库中同源性最为接近的菌株均为梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，表明该菌属于所均属的细菌。下载同源性较高的细菌序列，用CLUSTAL X program软件进行多序列比对分析并构建系统发育树，结果表明:JGC-3与GenBank报道的其他A型肉毒梭菌株形成一个簇群，与GenBank中登录号为X73844.1的A型肉毒梭菌的亲缘关系最近，结合该菌的形态学和生理生化特性，将其鉴定为A型肉毒梭菌，序列比对的同源性分析和进化树构建如图4所示。

图4 JGC-3及相关梭菌属菌株的系统进化树

3 结论

本实验从新疆察布查尔锡伯族自治县的土壤中分离出一株细菌，经形态学和生理生化特征分析，结合16SrDNA序列分析对其进行研究，主要结论如下:

(1)在生理生化鉴定中，目标菌可分解葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖，不发酵半乳糖、甘露醇、甘露糖。石蕊牛乳培养基变蓝色，在培养后期，产生大量气体。明胶液化试验中，明胶最后呈液体状态，反应呈阳性。

(2)采用通用引物和特异性引物对目标菌的DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测有清晰条带。所得PCR产物测序结果进行BLAST分析后，其与GenBank中A型肉毒梭菌序列相似度高达97%，将其确定为A型肉毒梭菌。

［1］ 温玉梅．现代医学微生物学［M］．上海:上海医科大学出版社，1999:243－247.

［2］ 刘长文，梁艳华，祁兴州．肉毒中毒的发生及特点［J］．承德医学院学报，1995(12):59－61.

［3］ Gao Q Y，Huang Y F，Wu J G，et al．A review of botulism in china［J］．Biomed En-viro Sci，1990(3):326 － 336.

［4］ Jankovic J，Brin MF．Therapeutic uses of botulinum toxin［J］．N Engl J Med，1991，324:1 186 －1 194.

［5］ Whitby M，Street AC，Ruff TA，et al．Biological agents as weapons:Smallpox and botulism ［J］．Med J Aust，2002，176(9):431－433.

［6］ 夏宏器，刘国全．肉毒中毒［M］．新疆:新疆人民出版社，1982:18－22.

［7］ 江扬．肉毒梭菌的筛选及菌株的鉴定［D］．南京:南京工业大学，2003.

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［9］ 布坎南 R E．伯杰细菌鉴定手册［M］．北京:科学出版社，1984:768－773.

［10］ Ghalfi H，Allaoui A，Destain J，et al．Bacteriocin activity by Lactobacillus curvatus CWBI-B28 to inactivate Listeria monocytogenes in cold － smoked salmon during 4°C storage［J］．J food pro，2006，69:1 066 －1 071.