张红艳，王春玉，李彦姝，王迪，李丰

(中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室，细胞生物学卫生部重点实验室，辽宁沈阳 110001)

Rho家族鸟苷三磷酸酶(Rho、Rac、Cdc42)作为调节不同细胞进程的分子开关，参与从细胞黏附、迁移到细胞生存、凋亡的过程［1］。p21活化的激酶(PAKs)是Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白。到目前为止，PAK家族共有6个成员［2］，所有成员都包含一个高保守的丝氨酸苏氨酸激酶结构域，其激酶活性与PAKs执行细胞功能有关［2］。PAKs与多种细胞内蛋白相互作用，提示PAKs是多向性激酶，参与多种细胞信号通路，例如:参与细胞骨架的信号通路，参与细胞生存通路［3］。根据结构和序列同源性将PAKs分为两大类:Ⅰ类 PAK成员包括 PAK1、PAK2、PAK3，Ⅱ类 PAK成员包括 PAK4、PAK5、PAK6［4］。

PAK4是目前研究较为广泛的Ⅱ类PAK，并且表达广泛，胚胎及成年组织中均有表达，尤其在前列腺、睾丸、结肠组织中高表达［5］。PAK4与肿瘤关系非常密切，PAK4在许多肿瘤细胞系中和源于乳腺、肺、胰腺、结肠、前列腺的肿瘤中高表达［6-9］。PAK4的研究对于肿瘤的发生发展以及治疗有非常重要的作用。本研究构建3*Flag-hPAK4质粒，纯化PAK4蛋白，研究PAK4相互作用蛋白，为肿瘤信号转导通路提供依据，可以使用标签抗体Flag观察PAK4在细胞中的定位。

1 材料与方法

1． 1 菌株、细胞和质粒

大肠杆菌DH5α感受态为本实验室制备，MCF-7乳腺癌细胞系和COS7细胞为本实验室保存，3*Flag载体购自Sigma公司。

1． 2 主要试剂

PyrobestTMDNA polymerase、dNTP、DNA 电泳凝胶回收试剂盒、反转录试剂、限制性核酸内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ均购自大连 TaKaRa公司;TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司;DNA marker、Protein marker购自GenScript公司;T4 DNA连接酶购自NEB公司;Flag抗体购自上海Genomics公司;HRP标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Alexa Fluor 594、DAPI购自 Invitrogen公司;引物合成、DNA测序由上海生物工程有限公司完成;ECL发光试剂盒购自购自GE Healthcare公司;其他试剂均为国产分析纯。

1． 3 MCF-7乳腺癌细胞RNA提取及反转录

MCF-7细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养至90%融合，提取细胞总RNA。在3.5 cm直径的培养板中加入1 ml TRIzol，用移液器反复吹打，直到细胞全部裂解。RNA提取过程按照Invitrogen公司提供的TRIzol说明书进行操作。测RNA的OD260和OD280值，计算比值和浓度。将MCF-7提取的RNA稀释到浓度为 1 μg·μl－1，进行反转录。操作步骤按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行。

1． 4 hPAK4全长基因扩增

设计hPAK4扩增的PCR引物，并在引物中加入了EcoRⅠ和BamHⅠ两个限制性酶切位点。上游hPAK4引物为5'-TCCAGAATTCCATGTTCGGGAAGAG GAAG-3'，下游 hPAK4引物为 5'-ATATTGGATCCT CATCTGGTGCGGTTCTG-3'。以MCF-7 cDNA为模板PCR扩增hPAK4全长编码序列。

1． 5 3*Flag-hPAK4表达载体的构建

将3*Flag载体和hPAK4 PCR片段分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，凝胶回收纯化产物。将两个片断用T4 DNA连接酶常温连接2 h，然后16℃连接过夜，取5 μl转化到大肠杆菌感受态DH5α中，37℃培养过夜。挑取菌落，接种于含氨苄西林的LB培养基中，37℃振荡过夜。用碱裂解法提取质粒DNA，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定外源基因的插入，质粒DNA送上海生物工程有限公司进行测序分析。

1． 6 3*Flag-hPAK4瞬时转染COS7细胞系

COS7细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，细胞铺于六孔板至70% ～80%融合，按照Abmart公司提供的TranSmarter转染六孔板的说明书进行操作。

1． 7 蛋白质提取与Western blotting鉴定

转染24 h后，弃掉培养基，用PBS清洗两遍。在细胞中加入60 μl含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用橡皮刮刀将细胞缓慢刮下。收集所有液体到新的离心管中，冰上放置10 min裂解细胞。13 000×g 4℃离心30 min，将上清转到新的离心管中，取上清5 μl，选用G250考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。

将蛋白定量后，取 80 μg总蛋白经 10%SDS-PAGE凝胶分离，4℃过夜40 V恒压转移到PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭1 h。用Flag抗体(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶5 000稀释)孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影。

1． 8 共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-PAK4细胞内定位

将3*Flag-PAK4转染到COS7细胞中，24 h后用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100通透细胞膜，山羊血清封闭1 h，anti-Flag抗体(1∶150稀释)室温孵育1 h，PBS洗3 次，每次 10 min，Alexa Fluor 594(1∶100稀释)室温孵育1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI(1∶1 000稀释)室温孵育 20 min，PBS洗 3次，每次10 min，使用50%甘油封片。在激光共聚焦显微镜下观察，红色区域为PAK4蛋白在细胞内的定位，蓝色代表细胞核。

1． 9 免疫沉淀

将COS7细胞均匀分配，铺于两个10 cm培养板中至 70% ～80%融合，按照 Abmart公司提供的TranSmarter转染试剂说明书进行操作。其中一个转染3*Flag空载，另一个转染3*Flag-hPAK4质粒。24 h后收集细胞，使用免疫沉淀裂解液裂解细胞，10 000 r·min－1离心30 min，转移上清到新的 EP 管中，加入4 μl anti-Flag抗体，4℃旋转1 h，加入50%Protein A beads 30 μl 4℃旋转3 h，用免疫沉淀裂解液洗涤3次，500×g离心2 min，弃上清。加入等体积的2*loading buffer，SDS-PAGE凝胶分离，4℃过夜40 V恒压转移到PVDF膜上，5% 脱脂奶粉封闭1 h。用anti-Flag抗体(1∶1 000稀释)室温孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶5 000稀释)孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影。

2 结 果

2． 1 PCR反应扩增hPAK4基因全长

以MCF-7 cDNA为模板，特异性的引物进行聚合酶链反应扩增hPAK4基因全长。扩增条件为95℃5 min预变性;95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72℃ 10 min，温度降至4℃。1%水平琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后，在紫外灯下观察结果(图1)。

2． 2 重组质粒3*Flag-hPAK4的构建及鉴定

将重组质粒3*Flag-hPAK4用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后得到约6 100 bp和1 800 bp的两条带(图2)，重组质粒的酶切鉴定结果表明质粒构建成功，经过测序分析，外源系列在NCBI-Blast比对结果与hPAK4编码序列一致。

图1 PCR扩增hPAK4基因Fig 1 PCR amplification of the full length hPAK4

图2 BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定重组质粒3*Flag-hPAK4Fig 2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid 3*Flag-hPAK4

2． 3 Western blotting检测蛋白表达

分别将3*Flag空载和3*Flag-hPAK4转染COS7细胞，24 h后收集细胞，提取蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，Western blotting检测蛋白表达，转染3*FlaghPAK4，见一明显条带(图3)，空载体对照组未出现反应条带。3*Flag-hPAK4分子质量约为68 kDa，为质粒本身的3*Flag标签分子质量(1．65 kDa)和hPAK4分子质量68 kDa之和。表明构建的真核表达质粒在COS7细胞中表达。

2． 4 3*Flag-hPAK4在细胞内的定位

通过共聚焦激光扫描显微镜下观察3*FlaghPAK4在细胞内的定位(图4)，激发光分别为594 nm(红色)，340 nm(蓝色)。

图3 Western blotting检测3*Flag-PAK4融合蛋白的表达Fig 3 Western blotting detect the expression of 3*Flag-PAK4 fusion protein using anti-Flag mAb

图4 激光扫描共聚焦显微镜观察3*Flag-PAK4在COS7细胞内的定位Fig 4 Confocal microscopy pictures of COS7 cells show the subcellular localization of 3*Flag-PAK4

2． 5 免疫沉淀

分别将3*Flag空载和构建的3*Flag-hPAK4转染COS7细胞，24 h后收集细胞，提取蛋白，使用anti-Flag抗体沉降蛋白，经10%SDS-PAGE凝胶电泳，Western检测到被沉降的3*Flag-hPAK4蛋白的表达(图5)。

3 讨 论

Ⅱ类PAK是多向性的激酶，参与多种细胞功能，包括细胞运动、神经元生长的调节、激素信号通路、基因转录、细胞存活等。因此这些蛋白参与癌症的进展和神经系统疾病。其中PAK4是Ⅱ类PAK中发现最早，也是目前研究的最为广泛的成员。有证据表明PAK4通过两条不同的通路促进细胞存活:PAK4增加BAD 磷酸化水平［10］和延迟半胱天冬酶分裂［10-11］。在正常的细胞中PAK4能使细胞周期停滞，在高表达PAK4的细胞中，上调P53和细胞周期调节蛋白的表达［12］。PAKs影响细胞运动和细胞存活通路，已经成为癌症的治疗靶点。研究证明Ⅱ类PAK的活性影响癌细胞的性能。PAK4高表达是致癌的［6］，PAK4能抑制癌细胞凋亡，PAK4与肿瘤坏死因子α受体复合物相互作用，促进细胞存活通路［13］。体内试验表明PAK4能促进肿瘤发生，PAK4表达缺失减弱V12Ras引起的肿瘤发生［14］。肿瘤侵袭和转移是多阶段、多基因参与的过程，相关基因的调节机制异常复杂［15］。利用3*Flag-PAK4质粒研究PAK4对肿瘤转移侵袭的影响很有意义。

图5 3*Flag抗体免疫沉淀PAK4蛋白Fig 5 3*Flag antibody immunoprecipitate PAK4 protein

本研究为了能在真核细胞中表达PAK4蛋白，用于在体或离体的实验研究，深入探讨PAK4的生物学功能，利用DNA重组技术将PAK4重组到3*Flag载体中，通过酶切和测序保证扩增片段的正确性;通过Western blotting方法证实融合蛋白的正确性。融合蛋白中含有3*Flag亲和标签可用于辅助目标蛋白的纯化和检测。本研究构建了PAK4的真核表达载体，并且重组质粒中带有3*Flag标签，为Western blotting检测基因表达提供了保证。本实验通过亚克隆的方法成功构建了3*hFlag PAK4融合蛋白重组质粒，并验证了表达和定位，为从细胞和分子水平研究PAK家族的生物学功能奠定了良好的基础。

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