江洁，洪泽辉

(1．南京市市级机关医院内科，江苏南京 210018;2．东南大学医学院遗传与发育生物学系，江苏南京 210009)

Structure-specific recognition protein 1(SSRP1)是一个组蛋白的伴侣分子，在细胞内和Spt16相互作用形成一个异源二聚体FAcilitates Chromatin Transcription(FACT)［1-2］。最近研究发现，SSRP1 参与 Cisplatin诱导的DNA损伤应答［3］，但具体机制还不清楚。在本研究中，我们应用激光共聚焦显微镜技术观察到SSRP1快速聚集到激光诱导的DNA损伤部位，显示了SSRP1在DNA损伤应答中的动态变化情况，我们的结果证实SSRP1参与DNA损伤应答。

1 材料和方法

1． 1 材料

HeLa细胞，宿主菌E．Coli DH5α，绿色荧光载体EGFP-C1(本实验室保管)。

1． 2 方法

1．2．1 SSRP1 cDNA扩增 按RNA提取试剂盒(南京生兴生物技术有限公司)操作程序从HeLa细胞中提取总RNA，随后以1 μg RNA为模板，按逆转录试剂盒(大连宝生物工程有限公司)操作程序将mRNA逆转录为总cDNA。根据NCBI上SSRP1的基因序列，分别设计上下游引物，并在5'端加上相应酶切位点和保护性碱基。SSRP1上游引物:5'-AAACTCGAGATGGC AGAGACACTGGAGTTCAACGACGTC-3';下游引物:5'-TTTGCGGCCGCTCTCATCGGATCCTGACGCTGAGTC CTC-3'，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR扩增体系:cDNA模板3 μl，上下游引物分别为2 μl(终浓度0．8 pmol·μl－1)，dNTP 2 μl，5 × PCR buffer 5 μl，HS primerstar polymerase 0．25 μl(大连宝生物工程有限公司)，补加灭菌蒸馏水至25 μl。扩增条件为:预变性98℃ 30 s;变性98℃ 10 s，退火65℃15 s，延伸72℃ 2 min，35循环;最后延伸72℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1．2．2 EGFP-C1-SSRP1表达载体的构建 将在琼脂糖凝胶上的PCR产物进行割胶纯化，纯化后PCR产物用XhoⅠ和NotⅠ(大连宝生物工程有限公司)进行双酶切，酶切后后的PCR产物再进一步琼脂糖凝胶电泳、割胶和纯化。纯化后产物与已作相同酶切的EGFP-C1载体连接，随后涂平板、挑克隆、扩增，最后提质粒，用XhoⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定。鉴定后的质粒进行全基因测序，测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1．2．3 激光刺激诱导DNA损伤 将HeLa细胞种植在3．5 cm的玻璃底培养皿中，24 h后转染EGFP-SSRP1，同时在培养基中添加(或不添加)终浓度为10 mmol·L－1的BrdU。24 h后用激光共聚焦显微镜观察(FV1000，Olympus)培养皿中细胞，用405 nm激光照射细胞核指定区域，随后用488 nm激光观察绿色荧光变化并拍照。

2 结 果

2． 1 SSRP1基因cDNA的克隆结果

已知的SSRP1只有1个转录变异子，其cDNA长度为2 130 bp(包括终止密码子)。以HeLa细胞的cDNA为模板，用SSRP1的5'和3'引物进行扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳在大约2 100 bp的位置上出现目的条带(图1)。

图1 SSRP1基因克隆结果Fig 1 PCR amplification of SSRP1

2． 2 EGFR-SSRP1重组质粒的构建

SSRP1的PCR产物用XhoⅠ和NotⅠ双酶切后，克隆到相应双酶切的EGFP-C1载体。从大肠杆菌中提出的重组质粒用XhoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，插入的DNA片段与SSRP1的长度相一致(图2)。随后，重组质粒进行测序，测序结果与GenBank上的序列对比分析，证实完全一致，表明SSRP1基因的克隆和载体构建成功。

图2 重组质粒EGFP-C1-SSRP1的酶切鉴定Fig 2 Identification of EGFP-C1-SSRP1 by enzyme digestion

2． 3 激光诱导SSRP1蛋白聚集到的DNA损伤位点

将HeLa细胞种植在3．5 cm的玻璃底培养皿中，24 h后转染EGFP-SSRP1，同时在培养基中添加(或不添加)终浓度为10 mmol·L－1的 BrdU。再过24 h，将培养皿在激光共聚焦显微镜下观察。如图3所示，EGFP-SSRP1在细胞核内表达，呈均匀分布，但核仁内不表达EGFP-SSRP1。大量研究表明，激光照射可以造成DNA损伤。本实验用405 nm激光在细胞核指定区域照射，发现EGFP-SSRP1融合蛋白很快聚集到激光照射的位置。在细胞培养基添加(或不添加)BrdU的情况下，EGFP-SSRP1都有聚集现象，但很明显，添加BrdU的细胞中，EGFP-SSRP1的聚集更强、更明显。这也表明，SSRP1的聚集是针对于DNA的。细胞发生DNA损伤后，SSRP1快速聚集，激光照射后10 s时已有明显的SSRP1聚集，在30 min时还存在较强的聚集现象。此实验结果提示SSRP1快速参与DNA损伤应答和修复，并且是一个长时辰的效应因子。

3 讨 论

基因组稳定性对于维持生物体正常的生命活动有着极为关键的作用，但在生命活动过程中不可避免地会受到体内和体外多种因素的影响［4-5］。维持基因组稳定性主要通过细胞内的DNA损伤应答和修复系统来完成［4］。DNA损伤修复系统本身出现基因突变或缺损，将导致DNA损伤不能被修复或正确修复，引起基因组不稳定，从而产生各种遗传性疾病，并且和肿瘤、衰老以及神经退行性疾病等密切相关［6-9］。DNA损伤应答和修复是一个极其复杂的过程，包括DNA损伤识别、信号传导、DNA修复，同时还涉及到细胞周期调控、细胞凋亡、相关基因的转录调控等。最近几年，关于DNA损伤应答和修复的研究取得了很多进展，发现和鉴定了XLF，RNF和RAP80等多个DNA损伤应答和修复相关基因［10-12］。尽管如此，DNA损伤应答和修复分子机制仍存在许多未知的地方，有待于进一步研究。

图3 激光共聚焦显微镜观察SSRP1的聚集情况Fig 3 Recruitment of SSRP1 to DNA damage site induced by laser

在真核细胞中，DNA和组蛋白结合在一起，形成染色质/染色体结构。因此，DNA的转录、复制和修复等都不可避免和染色质的空间结构(染色质重塑)密切相关［13-14］。在染色质中存在多种组蛋白的伴侣分子，对于维持染色质的特定结构起着重要的作用。SSRP1是Bunker于1995年克隆鉴定出来的一个含有HMG-box的蛋白［15］。随后研究发现SSRP1和Spt16形成一个异源二聚体(即FACT)，是核内基因转录必须的组蛋白伴侣分子之一［1-2］。细胞核基因在转录的时候，FACT和转录区域的一个H2A、H2B异源二聚体相互作用，使H2A、H2B异源二聚体从核小体上脱落，协助RNA聚合酶的转录进展［16］。进一步研究发现，FACT还和DNA复制、DNA损伤应答及修复密切相关［3，17］，但具体的分子机制和功能并不清楚。在本实验中，我们成功地构建了EGFP-SSRP1表达载体，利用激光局部照射技术造成DNA损伤［18-20］，发现SSRP1快速聚集到激光照射位点，直观地提供了SSRP1对DNA损伤的动态应答情况。我们的研究结果证实SSRP1是DNA损伤应答的早期效应分子，但在DNA损伤应答中的具体功能，还有待于进一步研究。

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