姜淑娟，冯镇，赵新淮

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

酪蛋白的转谷氨酰胺酶酶促糖基化交联条件及产物性质

姜淑娟，冯镇，赵新淮

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

在氨基葡萄糖存在的条件下，利用转谷氨酰胺酶（EC 2.3.2.13）对酪蛋白进行糖基化交联修饰。以修饰酪蛋白产物中氨基葡萄糖的导入量为指标，采用单因素试验分别考察反应体系pH值、酶添加量、反应温度和时间对修饰反应的影响。优化后的适宜修饰条件为：酪蛋白底物质量浓度为30 g/L，氨基葡萄糖添加量为3 mol（每kg酪蛋白中）、pH值为7.5、酶添加量为10 kU（每kg酪蛋白中）、反应温度为37℃、时间4 h。与酪蛋白和转谷氨酰胺酶促交联的酪蛋白相比，修饰酪蛋白产物的乳化性质和胶凝性质得到显著改善，并且体外消化性能未受到影响，表明转谷氨酰胺酶催化的糖基化交联修饰可以用于改善酪蛋白的这些功能性质。

酪蛋白；转谷氨酰胺酶；氨基葡萄糖；修饰；功能性质

0 引 言

鉴于糖基对蛋白质功能性质的影响和酶法修饰的优越性，许多人利用氨基糖和转谷氨酰胺酶对食品蛋白质进行酶促糖基化修饰研究[1，2]。已有研究报导，利用氨基葡萄糖和转谷氨酰胺酶实现酪蛋白的糖基化交联，改善了酪蛋白修饰产品的溶解性质、起泡性质和黏度性质[3]。

本研究以酪蛋白为酰基供体、氨基葡萄糖为酰基受体、微生物转谷氨酰胺酶为催化剂，对酪蛋白的糖基化交联反应条件进行初步研究。以氨基葡萄糖导入量（mol/mol蛋白）为指标，单因素试验考察反应体系pH值、酶添加量、反应温度和时间的影响，并在最优条件下制备修饰酪蛋白产物，分析其乳化、凝胶性质和体外消化性能，以探讨转谷氨酰胺酶催化的糖基化交联修饰对酪蛋白产物的影响作用。

1 实 验

1.1 材料

酪蛋白，氨基葡萄糖盐酸盐（纯度＞99%），胃蛋白酶，胰蛋白酶，葡萄糖酸-δ-内酯，微生物转谷氨酰胺酶，一级精炼大豆油，研究用水为去离子水，HPLC分析所用试剂为液相纯，其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 主要设备

Waters 2695 HPLC系统，Foss 2300全自动凯氏定氮仪，LGJ-1型冷冻干燥机，DELTA 320型精密pH计，UV-2401PC型紫外可见分光光度计，BME100L高剪切混合乳化机，TA-XT2质构分析仪。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的糖基化交联修饰及修饰产物制备

在质量浓度为30 g/L的酪蛋白溶液中添加氨基葡萄糖至3 mol/kg（因为1 kg酪蛋白约含1 mol酰胺基团），保证蛋白质酰基供体与酰基受体的摩尔比为1︰3，用浓度为2 mol/L的NaOH调节pH值，添加一定量的酶液，混匀，置于37℃恒温培养箱内振荡反应。反应结束后，取出样品，置于85℃水浴中灭酶5 min，冷却。于4℃透析除去反应体系中未结合的氨基葡萄糖，样品冻干。利用HPLC分析修饰酪蛋白产物中氨基葡萄糖的导入量，方法同参考文献[3]，这里不作介绍。

以酪蛋白修饰产物中氨基葡萄糖的导入量为指标，采用单因素试验分别考察反应体系pH值、酶添加量、反应温度和反应时间的影响，以选择适宜的修饰反应条件。在优化的条件下制备修饰酪蛋白产物。交联酪蛋白对照样的制备方法同上,只是反应时不添加氨基葡萄糖，并与酪蛋白一起作为双对照。

1.3.2 乳化活性及乳化稳定性的测定

方法见文献[4]。用浓度为0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH值为7.0）配制质量浓度为1 g/L样品溶液。取75 mL蛋白样品溶液与25 mL一级精炼大豆油混合，于12 000 r/min均质1 min，静置10 min。 分别在0 min和静止10 min时从容器底部取50 μL乳液置于试管中，加入5 mL质量浓度为1 g/L的SDS溶液，混匀，于500 nm处测定吸光度（以质量浓度为1 g/LSDS溶液调整仪器零点）。

式中：C为乳化前蛋白样品溶液的浓度，g/mL；Φ为乳液中油相的体积分数，0.25；A0为乳液零时刻的吸光度；A10为乳液静置10 min的吸光度。

1.3.3 胶凝性质的测定

（1）酸凝胶的制备。称取一定量的样品配制质量浓度为40 g/L的溶液（pH值至7.0）。在同等规格的圆筒容器中填充等体积的样品溶液，加入一定量的葡萄糖酸-δ-内酯，搅拌均匀，置于40℃水浴中至pH值约为4.0，取出后4℃冰箱中保存，制得酸凝胶样品。

（2）胶凝性质分析。取出凝胶样品于室温放置2 h，然后将待测凝胶样品置于测定平台上固定好，室温下利用TA.XT-2型物性仪进行测量。以质构剖面分析法（TPA）测定凝胶的硬度和弹性等各项结构参数。所选用的探头为物性仪配备探头（型号为P/0.5）。重复测定3次，结果以平均值±标准偏差表示。

1.3.4 体外消化性能的分析[5，6]

一步水解法（胃蛋白酶水解）：取10 mL质量浓度为10 g/L的样品分散液（pH值为2.0），加入2 mg胃蛋白酶，于37℃水解2 h。加入等体积质量浓度为200 g/L的TCA溶液终止反应，在10 000 g下离心20 min，收集上清液。

二步水解法（胃蛋白酶—胰蛋白酶水解）：取10 mL质量浓度为10 g/L的样品分散液（pH值为2.0），加入2 mg胃蛋白酶，于37℃水解1 h。水解结束，置于90℃水浴中灭酶5 min，冷却后冻干。将冻干物重新溶解于10 mL浓度为0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH值为8.0）中，加入6 mg胰蛋白酶，于37℃继续水解1 h。然后加入等体积质量浓度为200 g/L的TCA溶液终止反应，在10 000 g下离心20 min，收集上清液。

利用紫外分光光度计测定两种方法所得水解上清液在280 nm处的吸光度，以反映蛋白样品中可消化蛋白质的质量浓度，近而说明蛋白样品的体外消化性能。

2 结果与讨论

2.1 酪蛋白的修饰反应条件

考察反应体系pH值、酶添加量、反应温度和时间单因素对酪蛋白修饰反应中糖基导入量的影响，单因素实验，结果如图1所示。

图1中，糖基导入量以每摩尔酪蛋白中导入的氨基葡萄糖摩尔数表示。根据文献，酪蛋白和氨基葡萄糖的分子质量分别以24 000 u和215 u计。数据均为3次重复实验的平均值±标准偏差，不同的上标字母表明数据差异显著（P＜0.05）。

（1）反应体系pH值。固定酪蛋白底物质量浓度为30 g/L和氨基葡萄糖添加量为3 mol/kg，在酶添加量为5 kU/kg、温度37℃、反应3 h时，反应体系pH值的影响如图1（a）。 在弱酸性（pH＜7.0）条件下，可能是由于氨基葡萄糖中氨基被质子化，多以-NH3+形式存在，糖基导入量较少；在中性或弱碱性（pH值为7.0～7.5）条件下，氨基葡萄糖的氨基以-NH2形式存在，其反应活性增加，pH值为7.5时，糖基导入量为最大，达到0.85 mol/mol酪蛋白。但在碱性（pH＞7.5）条件下，可能是酶活力受限，或酪蛋白中游离ε-NH2竞争反应，氨基葡萄糖的导入量降低。

（2）酶添加量。固定酪蛋白底物质量浓度和氨基葡萄糖添加量，在pH值7.5，温度37℃，反应3 h时，酶添加量的影响如图1（b）。酪蛋白中糖基导入量随酶量的增加而增加，在10 kU/kg时糖基导入最多，达到1.04 mol/mol酪蛋白；酶添加量继续增加，糖基导入量反而下降。这是因为反应体系存在酪蛋白自身交联与氨基葡萄糖导入两个反应竞争发生，酶添加量过高会导致酪蛋白迅速交联从而造成空间位阻，从而减少了氨基葡萄糖与蛋白底物结合位点接触的机会。因此，酶添加量以10 kU/kg为宜。

（3）反应温度。固定酪蛋白底物质量浓度和氨基葡萄糖添加量，在pH值为7.5，酶添加量为10 kU/kg，反应3 h时，温度的影响如图1（c）。随着温度升高，酪蛋白修饰产物中的糖基导入量增加，在度37℃得到最大糖基导入量（1.01 mol/mol酪蛋白）；温度高于37℃时，糖基导入量呈现下降趋势。这可能是在弱碱性条件下，以糖胺形式存在的氨基葡萄糖不稳定发生氧化等反应，导致参与糖基化反应的氨基葡萄糖减少。

（4）反应时间。固定酪蛋白底物质量浓度为和氨基葡萄糖添加量，在pH值为7.5、酶添加量为10 kU/kg、37℃进行修饰反应，反应时间的影响如图1（d）。在反应初始阶段，酪蛋白修饰产物中氨基葡萄糖的导入量随反应时间而显著增加，反应4 h时糖基导入量达到1.15 mol/mol酪蛋白；反应时间继续延长，而糖基导入量没有显著变化。因此，4 h为酪蛋白修饰反应的最适时间。

通过上述分析可知，当酪蛋白底物质量浓度为30 g/L、氨基葡萄糖添加量为3 mol/kg时，修饰反应的最优条件为：pH值7.5，酶添加量10 kU/kg，反应温度37℃，反应4 h。

2.2 乳化性质

蛋白则提高12%。修饰酪蛋白产品、酪蛋白和交联酪蛋白乳液的乳化稳定性指数分别为84.3%，70.5%和60.0%。与酪蛋白相比，交联酪蛋白的乳化稳定性下降15%，而修饰酪蛋白则提高20%。整体上看，转谷氨酰胺酶催化的糖基化交联修饰，提高了酪蛋白的乳化活性特别是乳化稳定性。修饰酪蛋白产物表现出较好的乳化能力，可能与亲水的葡萄糖基能够促进蛋白质在油-水两相界面吸附有关[7]。据报道，糖基化修饰提高蛋白质乳化稳定性，与糖-蛋白质结合体在界面重新定向排列有关：疏水的蛋白质残基向油相排列，亲水的糖基向水相排列，导入的糖基增加了蛋白质的表面亲水性，从而阻碍了油滴的聚集和凝聚，因而形成的乳液更加稳定[8]。

表1 酪蛋白、交联酪蛋白和酪蛋白修饰产品的乳化性质

表1中的数据均为3次重复实验的平均值±标准偏差，同一项指标内不同样品数值后不同的小写字母表明数据差异显著（P＜0.05）。

2.3 胶凝性质

根据酪蛋白的胶凝特性，利用葡萄糖酸-δ-内酯酸化的方法制得酪蛋白、交联酪蛋白和修饰酪蛋白的酸凝胶，其胶凝性质评价结果如表2所示。质量浓度为40 g/L酪蛋白溶液所制酸凝胶的硬度和黏性都较小，相比之下相同浓度交联酪蛋白和修饰酪蛋白的胶凝性质发生显著变化，主要表现为：交联酪蛋白和修饰酪蛋白的酸凝胶硬度分别提高2.5倍和1.9倍，黏附性分别增加1.7倍和6.2倍。与酪蛋白和交联酪蛋白的酸凝胶相比，修饰酪蛋白制备的酸凝胶硬度适中、黏性较大，显然是蛋白交联与糖基化修饰协同作用的结果。由于导入的葡萄糖基具有更好的的亲水性能，凝胶持水更多，因此修饰酪蛋白产品所制酸凝胶的黏性很大。

表2 酪蛋白、交联酪蛋白和酪蛋白修饰产品的胶凝性质

2.4 消化性能

体外消化的方法模拟修饰酪蛋白在体内的消化利用情况。其中，一步水解法是用胃蛋白酶水解，模拟样品在胃液中的消化利用情况；二步水解法是胃蛋白酶—胰蛋白酶水解，模拟样品在肠内的消化利用情况。以水解上清液在280 nm处的吸光度值反映样品经酶消化后释放肽量的多少，结果如图2所示。就胃蛋白酶的消化能力而言，修饰酪蛋白产物与酪蛋白相同，但交联酪蛋白的胃蛋白酶的消化能力下降（肽量比酪蛋白减少27.5%）。在胃蛋白酶—胰蛋白酶模拟肠液消化中，交联酪蛋白的消化性能与酪蛋白相同，修饰酪蛋白产物释放的肽量比酪蛋白增加9.8%，表明修饰酪蛋白的消化能力稍好于酪蛋白。体外消化研究表明，在氨基葡萄糖存在条件下转谷氨酰胺酶对酪蛋白的修饰作用不会损害酪蛋白的消化能力。

图2中，数据均为3次重复实验的平均值±标准偏差，不同的上标字母表明数据差异显著（P＜0.05）。

3 结 论

（1）在酪蛋白底物质量浓度为30 g/L，氨基葡萄糖添加量为3 mol/kg的条件下，以修饰酪蛋白产物中氨基葡萄糖导入量为指标，通过单因素试验得到适宜的条件：pH值为7.5，酶添加量为10 kU/kg，温度为37℃，时间为4 h。

（2）转谷氨酰胺酶催化酪蛋白的糖基化交联修饰改善了酪蛋白的一些功能性质。在蛋白质质量浓度为1 g/L时，修饰酪蛋白产物的乳化活性和乳化稳定性比酪蛋白分别提高12%和20%。与酪蛋白酸凝胶相比，相同浓度修饰酪蛋白产物制备的酸凝胶，硬度适中，黏性较大。同时，体外消化研究显示修饰酪蛋白产物的消化性能未受到损害。

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Optimal conditions to glycosylate and cross-link casein by transglutaminase and some functional properties of the modified product

JIANG Shu-juan,FENG Zhen,ZHAO Xin-huai
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030，China）

Glycosylation and cross-linking of casein catalyzed by transglutaminase in presence of glucosamine was studied in this work.When the concentration of casein was fixed at 3%（w/v）and glucosamine added to the final concentration of 3 mol glucosamine/kg casein,the content of glucosamine conjugated in the modified casein product was used as an index,the pH of reaction system,addition level of transglutaminase,reaction temperature and time were studied by single factor experiments.The optimal modification conditions final selected were as fellow：a pH of 7.5,enzyme addition level of 10 kU/kg casein,temperature of 37℃and reaction time of 4 h.Compared to the original casein and the cross-linked casein by transglutaminase,the modified casein product exhibited markedly improved emulsifying and gelation properties;moreover,its digestibility in vitro wasn’t impaired upon this modification.Our results indicated that glycosylation and cross-linking of casein catalyzed by transglutaminase could improve these important properties of casein.

Casein;transglutaminase;glucosamine;modification;functional property

Q936

A

1001-2230（2011）07-0025-04

2011-01-04

黑龙江省高等学校科技创新团队建设计划项目（项目编号2010td11），东北农业大学创新团队发展计划资助项目（项目编号CXT007-1-1）。

姜淑娟（1981-），女，博士研究生，从事食品蛋白质研究。

赵新淮