汪兴杰+张予林+刘吉彬+陶永胜

摘 要 建立了基于氨基柱的高效液相色谱分析媚丽葡萄香气糖苷的糖基组成的方法。媚丽葡萄果皮经提取缓冲液（0.1 mol/L Na2HPO4NaH2PO4，pH 7.0，13%（V/V）乙醇）浸提，葡萄香气糖苷提取物在柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 5.0）中用AR2000糖苷酶水解，释放出糖基，经氨基柱分离，用高效液相色谱示差折光检测器（HPLCRID）分析。色谱分析条件为：柱温35℃，RID温度35℃，进样量20 μL，流动相为乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15，V/V），流速1.0 mL/min。结果表明，鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖和葡萄糖在线性范围内线性关系良好（R2>0.996），检出限为93～123 mg/L，定量限309～409 mg/L， 5 g/L各单糖的峰面积的精密度（n=10）为2.3%～6.4%； 糖基样品的各单糖加标回收率在73.8%～125.7%之间。以糖基类别划分的媚丽葡萄各类香气糖苷的摩尔百分比为： 6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷，4.1%～6.1%； 6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷，2.3%～8.8%； 6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷，0.1%～3.9%； 6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷，5.5%～9.8%； 6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷，76.3%～86.8%。媚丽葡萄成熟过程中，各类香气糖苷的含量及其总量与浆果成熟度之间没有明显的相关性。

关键词 葡萄香气糖苷； 糖基组成； 氨基柱； 高效液相色谱示差折光检测器

1 引 言

香气糖苷是一类由糖基和挥发性香气成分（苷元）通过β糖苷键结合形成的香气前体物质[1]。欧亚种酿酒葡萄（Vitis vinifera）中的香气糖苷最早在亚历山大玫瑰香（Muscat of Alexandrie）葡萄中发现[2]，并于1982年首次进行了结构鉴定[3]。研究发现，葡萄中香气糖苷主要是二糖苷，单糖苷很少，三糖苷极少存在。香气糖苷结构中与苷元直接连接的糖分子是葡萄糖，与葡萄糖相连的是鼠李糖、木糖、阿拉伯糖或芹菜糖等[4～6]。研究香气糖苷水解后的糖基组成，对于准确推测香气糖苷的结构，具有重要的理论意义和实际参考价值。此外，不同品种葡萄具有不同的香气物质组成，分析香气糖苷的糖基组成，是研究葡萄果实及其葡萄酒香气特征的重要手段。香气糖苷在酸解和酶促水解条件下会释放出挥发性的香气成分，通常采用气相色谱（GC）进行香气糖苷水解后游离成分的分离鉴定[7，8]，进而推测香气糖苷的化学组成。液相色谱质谱联用可以直接无损分析香气糖苷[9，10]，但由于缺乏标准品以及受到其它糖苷的干扰，所鉴定香气糖苷的化学类别和数量有限。虽然GC是目前香气糖苷鉴定的主要方法，但水解过程很有可能伴随目标香气成分的分子重排，导致GC分析的误差[11]。此外，葡萄香气糖苷中糖基葡萄糖的含量占绝对优势，糖苷水解后糖基分离的过程中，由于葡萄糖和其它干扰物的影响，采用色谱分离鉴定其它糖基难度较大，因此除含量最高的糖基葡萄糖外，香气糖苷的其它糖基的研究鲜有报道[12～14]。

本课题组前期对酿酒葡萄新品种陕西杨凌“媚丽”（Vitis vinifera L. Meili）[15]酿造的媚丽葡萄酒的香气成分[16，17]、感官质量[18]以及香气糖苷的苷元[19]进行了初步研究。本研究采用高效液相色谱示差折光检测器（HPLCRID）建立了基于氨基柱的香气糖苷的糖基分析方法，揭示媚丽葡萄香气糖苷的糖基组成，研究其与葡萄成熟度之间的联系。本方法可对香气糖苷进行定性与定量分析，为探讨香气糖苷的糖基与苷元的数量关系的研究提供了方法和参考数据。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC10ATVP液相色谱仪、RID10A示差折光检测器、CT010ASP柱温箱（日本岛津公司）； N2000色谱工作站（杭州忆捷科技有限公司）； TGL16M台式高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）； SPE12固相萃取装置（北京开源国创科技有限公司）； SepPak C18固相萃取小柱（美国Waters公司）； Synergy纯水制备仪（美国Millipore公司）。

L（+）阿拉伯糖（纯度99%，德国Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司）； D芹菜糖（纯度98%，百灵威科技有限公司）； D（+）葡萄糖、L鼠李糖、D（+）木糖（纯度99%，上海源叶生物科技有限公司）。以上试剂均为色谱纯。糖苷酶AR2000（250 U/g，荷兰DSM Food Specialties 公司）。

媚丽葡萄于2015年采摘自陕西杨凌曹新莊（北纬34°18′，东经108°05′）葡萄园，采收时期8月16＼， 21、26、31日及9月5和11日。浆果含糖量为170～218 g/L，含酸量（以酒石酸计）为4.8～6.6 g/L。

2.2 葡萄香气糖苷提取及酶解

香气糖苷浸提、纯化和酶解分别参照文献[8，20，21]的方法，略有改动。葡萄果皮于缓冲液（0.1 mol/L Na2HPO4NaH2PO4，pH 7.0，13%（V/V）乙醇）中4℃避光浸提48 h。浸提液在4℃以10000 g离心30 min，35℃旋转蒸发去除乙醇，用0.45 μm滤膜过滤，过C18固相萃取柱，C18柱先依次用二氯甲烷、甲醇、水各10 mL活化，上样后，再分别用50 mL水、8 mL戊烷二氯甲烷（2∶1，V/V）淋洗，最后用8 mL乙酸乙酯甲醇（9∶1，V/V）洗脱香气糖苷。香气糖苷收集液于40℃旋转蒸发至干，复溶于2 mL 柠檬酸磷酸盐缓冲液（pH 5.0），加入80 mg 糖苷酶AR2000，40℃水解16 h，得糖基样品溶液。

2.3 液相色谱分析

2.3.1 糖标准液的制备 准确称取葡萄糖、芹菜糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖的标准品各25.0 mg，用柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液（pH 5.0）配成5.0 g/L糖混合标准溶液（母液）。同时配制5.0 g/L单糖标准溶液，取适量母液进行倍比稀释，用于建立单糖的标准曲线。

2.3.2 液相色谱分析条件 Agilent ZORBAX NH2氨基柱（250 mm × 4.6 mm， 5 μm， 美国Agilent公司），柱温：35℃； RID温度：35℃； 流速：1.0 mL/min； 进样量：20 μL。流动相为乙腈乙酸乙酯水， 通过实验确定最佳配比。

2.3.3 单糖组分鉴定及精密度实验 5.0 g/L单糖标准溶液分别进样，确定各单糖的保留时间，进行3次平行实验。连续进样10次，计算各单糖峰面积的相对标准偏差（RSD）值。

2.3.4 样品测定及其组分鉴定 分别取适量样品溶液及对照组溶液，过0.45 μm滤膜，液相色谱分析，重复测定3次。对比樣品中物质峰与单糖标准品的出峰时间，确定样品中的糖基类别。

2.3.5 加标回收实验 糖基样品溶液与2 g/L混合糖标准溶液等体积混匀，过0.45 μm滤膜，进样分析，重复测定3次。分别测定各个糖基样品的初始各单糖浓度，以及加标后各单糖浓度，计算回收率。

3 结果与讨论

3.1 方法学考察

3.1.1 流动相配比选择 单糖标准品的高效液相色谱图见图1。结果表明，流动相为乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15，V/V）时，各单糖的分离效果最佳，色谱峰可以实现分离。而增加乙腈含量，降低乙酸乙酯含量，会使各峰分离度变小。因此，选择乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15，V/V）为流动相进行分离。

3.1.2 线性关系、检出限和精密度 通过倍比稀释母液得工作溶液，建立单糖浓度与色谱峰面积的线性回归方程，各浓度平行测定3次。以乙腈乙酸乙酯水（60∶25∶15， V/V）为流动相，高效液相色谱示差折光检测器进行检测，各单糖浓度与峰面积的线性关系良好，检出限（LOD， S/N=3）为93～122 mg/L， 定量限（LOQ， S/N=10）为309～408 mg/L。5 g/L各单糖峰面积RSD在2.3%～6.4% （n=10）之间，精密度良好（见表1）。

3.1.3 加标回收率 不同时期的媚丽葡萄的糖基样品的加标回收率（平均值±标准差（n=3））见表2，

3.2 媚丽葡萄香气糖苷的糖基组成

糖基葡萄糖可以采用酸水解香气糖苷的方式制备[13，14]，但是实际研究中酸水解溶液的pH值通常较低，易引起苷元的分子重排，甚至是糖基分子的变化。葡萄酒酿造环境条件下，有研究采用外源糖苷酶促进香气前体物质的水解，进行增香酿造的尝试[22]。 本研究采用AR2000糖苷酶进行香气糖苷的水解，糖基样品的液相色谱图如图2所示，AR2000对香气糖苷的水解效果总体较好，HPLCRID方法能够实现糖基的类别分析。样品中检测到的糖基类别为鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖和葡萄糖，与文献[6]报道的葡萄香气糖苷的糖基组成一致。

媚丽葡萄香气糖苷的糖基含量（以葡萄果实质量换算，μg/g）如图3所示，浆果成熟过程中葡萄糖基、各戊糖糖基及其总体含量呈无明显规律的变化。糖基含量占糖基总量的百分比为：鼠李糖，1.88%～2.80%； 木糖，0.96%～3.73%； 阿拉伯糖，0.04%～1.26%； 芹菜糖，2.32%～4.17%； 葡萄糖，89.73%～94.28%。

酿酒葡萄的采收期的确定，常用糖酸比作为依据。图3D是以糖酸比表示的媚丽葡萄的浆果成熟变化。糖酸比的不断增大与糖基含量的无规律变化，表明媚丽葡萄香气糖苷的各糖基含量及其总量与浆果成熟过程无明显相关性，这也间接表明香气糖苷的糖基组成与浆果成熟度之间没有直接关系。不同香气糖苷的含量变化情况不尽相同，香气糖苷的积累与葡萄浆果的成熟度是相互独立的[23，24]，并且香气糖苷的含量变化与温度有很大关联[23]。所以，葡萄成熟期晴雨天的交替变化及温度的升降变化都有可能影响香气糖苷的糖基组成的含量变化。

葡萄香气糖苷主要为双糖苷，包括6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷、6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷[6]，而单糖苷仅发现含量较少的βD吡喃葡萄糖苷[5]。因为本研究检测出以上糖苷分子中的全部单糖分子，

所以推测媚丽葡萄含有这5种香气双糖苷。戊糖参与形成的都是二糖苷[5，6]，因而戊糖苷的糖基葡萄糖与戊糖的摩尔数相同。以摩尔数计，5种香气糖苷分别占香气糖苷总量的比例见表3。Maicas等[5]研究了一些葡萄品种中以糖基划分的香气糖苷含量，发现香气糖苷种类及其含量与葡萄品种有关，有些葡萄品种的果实中6OβD呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷约占总量的50%，6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷在6%～13%之间[5]。本研究采用摩尔百分比表示的媚丽葡萄香气糖苷含量，含量最高的是6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷，占总量的76.3%～86.8%。其它香气糖苷的摩尔百分比为：6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷，4.1%～6.1%； 6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷，2.3%～8.8%； 6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷，0.1%～3.9%； 6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷，5.5%～9.8%。除葡萄品种外，香气糖苷的糖基组成与葡萄栽培地域的气候、土壤，以及葡萄栽培模式、年份等因素是否相关，还需深入研究。

4 结 论

建立了葡萄果皮香气糖苷的糖基类别的LCRID分析方法。在葡萄成熟期间，媚丽葡萄以糖基划分的香气糖苷的摩尔百分比分别为：6OαL吡喃鼠李糖基βD吡喃葡萄糖苷，4.1%～6.1%； 6OβD吡喃木糖基βD吡喃葡萄糖苷，2.3%～8.8%； 6OαL呋喃阿拉伯糖基βD吡喃葡萄糖苷，0.1%～3.9%； 6OαL呋喃芹菜糖基βD吡喃葡萄糖苷，5.5%～9.8%； 6OβD吡喃葡萄糖基βD吡喃葡萄糖苷，76.3%～86.8%。媚丽葡萄成熟过程中各类香气糖苷含量及其总量与浆果成熟度无明确相关性。

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