张乃菊，陈天平，董淑英，张月林，李筱俊，余美玲，祝晓光

信号传导通路在细胞分化、增殖与凋亡中起着重要作用。ERK1/2是受外界刺激时决定细胞命运的关键因素，ERK1/2的活化是将信号从细胞表面受体转导至胞核的关键步骤，ERK1/2在刺激中被激活，同时其持续活化最终促进细胞增殖和恶性转化。目前，赖氨匹林(即阿司匹林与赖氨酸的复盐，主要成分为阿司匹林)对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用是否与ERK信号通路有关尚不明确。本实验旨在研究aspisol对宫颈癌HeLa细胞株ERK1/2、PERK1/2和COX-2蛋白表达的影响，初步探讨aspisol在体外对人宫颈癌HeLa细胞的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人宫颈癌HeLa细胞株引自美国模式菌种保藏中心(ATCC)，由本实验室保种。

1.2 药品和试剂 aspisol购于安徽丰原药业股份有限公司，批号081106;DMEM培养基和胰蛋白酶:Gibco公司;胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购于杭州四季青公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购于晶美生物工程有限公司;山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记兔抗山羊IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG-HRP:中杉金桥生物技术有限公司;兔ERK-1、ERK-2多克隆抗体、小鼠P-ERK单克隆抗体、小鼠抗人GAPDH单克隆抗体、山羊COX-2多克隆抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒和Western blot荧光试剂:Santa Cruz公司。

1.3 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞株常规培养于低糖DMEM培养基(含体积分数为0.10 FCS，20 mmol·L－1Hepes，2.0 g·L－1碳酸氢钠，1 ×105U·L－1青霉素和 10 mg·L－1链霉素)，置 37℃、0.05 CO2、0.90相对湿度细胞培养箱中培养传代，取对数生长期细胞进行实验。实验分为5组:阴性对照组只加等体积的低糖DMEM培养液的HeLa细胞;实验组加入不同浓度的aspisol，使其终浓度分别为1、5、10 mmol·L－1;阳性药组加入 ERK1/2 抑制剂U0126，使其终浓度为 10 μmol·L－1。

1.4 MTT法检测aspisol对HeLa细胞的增殖抑制作用 取对数生长期的HeLa细胞，按2×107·L－1接种于96 孔培养板，每孔接种200 μl，用含0.10小牛血清DMEM培养液培养24 h后，用无血清DMEM培养液培养24 h后采用不同的给药方案(同“1.3”)，每组设6个复孔，实验重复5次，加药处理后的24、48、72 h 加入20 μl 5 g·L－1的 MTT 溶液。继续孵育4 h后，仔细吸去上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，于微量震荡器上轻轻震荡以使甲臢完全溶解，30 min后在492 nm波长处用酶联免疫检测仪测吸光度值(A492)。根据公式计算不同浓度药物对HeLa细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1－实验组 A492值/阴性对照组 A492值)×100%［1］。

1.5 细胞增殖能力测定 采用Dr.Glazer报道的“标准细胞集落形成分析法”［2］测定aspisol对培养细胞的细胞集落(克隆)形成的影响。取对数生长期的HeLa细胞按1×108·L－1将实验细胞接种到6孔板，每孔2 ml，置于培养箱中培养。48 h加药(给药方案同“1.3”)，共同孵育1 h后经0.25%的胰蛋白酶消化制备成单个细胞悬液，接种于6孔板，每孔1 000个细胞，置于37℃、0.05 CO2培养箱中培养，持续培养7 d，出现肉眼可见的克隆。常规吉姆萨染色，干燥后镜下计数大于50个细胞的克隆数。

细胞集落形成率/%=各组细胞集落数/对照组细胞集落数×100%。

1.6 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡 取对数生长期的HeLa细胞以1×108·L－1接种于6孔板中，每孔2 ml，待细胞贴壁后加入无血清培养液培养24 h，换新鲜培养液采用不同的给药方案(同1.3)，药物作用24 h后收集细胞。用4℃预冷的PBS洗细胞两次，取250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1 ×109·L－1;取100 μl的细胞悬液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC 和10 μl 20 mg·L－1的碘化丙啶溶液，混匀后于室温避光温育15 min。在反应管中加400 μl PBS，用流式细胞仪检测(实验重复3次)，结果采用Winmdi 2.9软件分析处理。

1.7 Western blot法检测 HeLa细胞 ERK、PERK、COX-2的表达 常规收集不同的给药方案(同1.3)作用24 h后的宫颈癌HeLa细胞，加入冰预冷的细胞裂解液 (总体积200 ml:100 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L－1NaCl 28 ml、100 mmol·L－1CaCl21 ml、100 mmol·L－1MgCl221 ml、15 mmol·L－1NaN340 ml、Triton X-100 2 ml，用前加入蛋白酶抑制剂 12 μmol·L－1Leupeptin、1 mmol·L－1PMSF 各 2 ml·L－1)冰上裂解 30 min，提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测定细胞提取物的蛋白浓度。用细胞裂解液将各组蛋白稀释至等浓度，与2×上样缓冲液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白变性。取蛋白每组40 μg，10%SDS-PAGE凝胶电泳(70 V，30 min，100 V，90 min);转膜(200 mA，3h)至PVDF膜;50 g·L－1脱脂牛奶室温封闭2 h(或4℃过夜);一抗:1∶500，室温孵育2 h(或4℃过夜);TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次;二抗:1∶7 000，室温孵育2 h;TPBS洗涤3次，PBS洗涤1次;将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，放入凝胶图像分析系统进行扫描和拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2 结果

2.1 Aspisol对HeLa细胞的增殖抑制作用 随着浓度的增加，aspisol对HeLa细胞的抑制率明显增加(P＜0.01);每一个浓度的aspisol对HeLa细胞增殖的抑制作用随作用时间的延长而增强。1 mmol·L－1的aspisol就能对HeLa细胞产生抑制作用，10 mmol·L－1的aspisol抑制作用在72 h后达到(59.1±4.7)%，见 Fig 1。

Fig 1 The inhibitory effects of aspisol on the proliferation of HeLa cells( ± s，n=6)*P ＜0.05 vs aspisol 1 mmol·L－1group

2.2 Aspisol对HeLa细胞集落形成的影响 以细胞集落形成率的降低作为aspisol的细胞毒性指标。我们按照每孔1000个的细胞浓度将HeLa细胞接种到6孔板中。7 d后出现肉眼可见的集落。集落形成数量在 1、5、10 mmol·L－1aspisol处理的情况下与阴性对照组相比分别降低到(96.22±0.18)%、(73.02±1.35)%、(48.17±2.05)%;U0126 10 μmol·L－1与阴性对照组相比降低到(61.27±1.25)%。aspisol(l mmol·L－1)与阴性对照组比较，差异无显著性(P ＞0.05)，aspisol(5、10 mmol·L－1)和10 μmol·L－1U0126 与阴性对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)，提示aspisol有一定的毒性作用。

2.3 Aspisol对 HeLa细胞凋亡的影响 1、5、10 mmol·L－1aspisol和 10 μmol·L－1U0126 分别作用于HeLa细胞24 h后细胞凋亡率分别为(5.74±0.87)%、(13.01±1.85)%、(23.42±3.12)%和(19.22±2.86)%，与阴性对照组(0.46±0.19)%相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

2.4 Western blot法检测 aspisol对 HeLa细胞ERK、P-ERK、COX-2蛋白表达的影响 各组HeLa细胞均有两条条带(磷酸化ERK1/2和总ERK1/2)，上面一条带为44 ku的ERK1(p44)，下面一条带为 42 ku的 ERK2(p42)，磷酸化 ERK1/2是ERK1/2的活性形式。与对照组相比，阳性药10 μmol·L－1的U0126 作用于HeLa细胞24 h后，能够下调P-ERK1/2的表达(P＜0.01);实验组不同浓度aspisol作用于HeLa细胞24 h后，磷酸化ERK1/2逐渐减少(P＜0.01)。这表明 aspisol抑制了ERK1/2信号传导通路，且随着aspisol作用浓度的增加，P-ERK1/2蛋白表达逐渐降低，呈现浓度依赖的趋势，但总ERK1/2蛋白表达水平不变。

COX-2蛋白分子量为72 ku，免疫杂交后在72 ku位置出现阳性条带。实验结果显示与对照组相比，阳性药 U0126 10 μmol·L－1作用于 HeLa 细胞后，能够下调COX-2的表达(P＜0.01);实验组随着aspisol浓度的逐渐增加，COX-2表达水平逐渐降低(P＜0.01)。内参GAPDH蛋白(分子量为37 ku)表达水平不变，见Fig 2、3。

Fig 2 The expression of the ERK and p-ERK proteins in HeLa cells after exposure to aspisol for 24 h( ± s，n=3)A:Control group;B:Aspisol 1 mmol·L －1;C:Aspisol 5 mmol·L －1;D:Aspisol 10 mmol·L －1;E:U0126 10 μmol·L －1

Fig 3 The expression of the COX-2 proteins in HeLa cells after exposure to aspisol for 24 h(±s，n=3)A:Control group;B:Aspisol 1 mmol·L －1;C:Aspisol 5 mmol·L －1;D:Aspisol 10 mmol·L －1;E:U0126 10 μmol·L －1

3 讨论

非甾体抗炎药抑制多种肿瘤细胞生长主要通过两种途径发挥作用，即抑制增殖及诱导凋亡，如aspisol通过抑制Survivin、C-erbB-2的表达，诱导细胞凋亡，抑制黑色素瘤细胞增殖［3］。笔者通过 MTT、细胞集落形成、流式细胞仪等实验证实aspisol能够有效抑制HeLa细胞增殖、诱导其凋亡，且随着浓度的增加，抑制率和凋亡率均上升。

越来越多的研究发现，ERK1/2通路的激活在细胞增殖失控引起的肿瘤发生中起重要作用。在人结肠癌、乳腺癌、胃癌和肺癌等多种肿瘤中，均可检测到ERK表达水平增高。因此推测，抑制ERK1/2的激活将可能促进肿瘤细胞凋亡的敏感性。实验结果表明，在宫颈癌HeLa细胞中ERK1/2表达增多，阳性药ERK通路选择性抑制剂U0126能够明显下调P-ERK1/2的表达;实验组aspisol可呈浓度依赖性抑制 HeLa细胞中磷酸化ERK1/2的表达，但不影响总ERK1/2的表达。因此，ERK1/2活性抑制可能是aspisol抑制HeLa细胞的分子机制之一。这与前期实验结果一致［4－5］。正常的生理状态下COX-2几乎不表达或表达甚少，而在癌前病变组织和癌变组织中，COX-2的水平都有上升。COX-2可能是通过影响细胞的生长增殖及分化、抑制细胞凋亡、增加肿瘤侵袭力等达到致癌的作用。本实验结果表明:HeLa细胞COX-2表达增高，aspisol呈浓度依赖性抑制COX-2的表达;ERK通路选择性抑制剂U0126 10 μmol·L－1作用于 HeLa 细胞后，能够下调COX-2的表达，这与刘冬妍等［6］结果一致，这表明COX-2表达可能由MAPK家族的一个成员ERK途径调控。

综上所述，aspisol可能是通过抑制HeLa细胞ERK1/2的磷酸化进而下调COX-2的表达，抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡而达到治疗宫颈癌的目的，但ERK1/2-MAPK信号通路与COX-2途径之间具体的细胞内信号调控机制仍不完全清楚。有文献报道［7］在肿瘤细胞中存在着这样的通路:蛋白激酶C→MAPK→AP-1→COX-2，AP-1的激活可促使COX-2的表达，但aspisol是否通过上述通路还有待于更深入的研究。

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