周爱梅，龚 翠，曹 环，郭伟杰，刘 欣，陈永泉

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

几种新型抗冻剂对鲮鱼鱼糜蛋白抗冻效果研究

周爱梅，龚 翠，曹 环，郭伟杰，刘 欣，陈永泉

（华南农业大学食品学院，广东广州510642）

以盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、总巯基含量、二硫键、表面疏水性、凝胶强度为指标，研究了海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠在8%（w/w）水平上对鲮鱼鱼糜蛋白在-18℃冻藏26周后的抗冻效果，并将其抗冻效果与传统商业抗冻剂（4%蔗糖+4%山梨糖醇）进行了对比。结果表明：海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠的加入均能较好地抑制冻藏鲮鱼鱼糜蛋白的冷冻变性，且乳酸钠具有比传统商业抗冻剂更好的抗冻效果，表现在它比传统商业抗冻剂更好地抑制鲮鱼鱼糜盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巯基含量和凝胶强度的下降以及防止鱼糜蛋白表面疏水性及二硫键的增加；海藻糖的抗冻效果也优于传统商业抗冻剂，其抑制二硫键的增加及维持鱼糜盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巯基含量和凝胶强度的能力均强于商业抗冻剂；聚葡萄糖的抗冻效果与商业抗冻剂相当，其在抑制鲮鱼鱼糜盐溶性蛋白含量、巯基含量、凝胶强度的下降及二硫键、表面水性的增加方面的能力均与传统商业抗冻剂相当。因此，上述三种物质可作为低甜度、低热值的抗冻剂用于鱼糜加工业，以代替高甜度、高热值的传统商业抗冻剂。

鲮鱼鱼糜，海藻糖，聚葡萄糖，乳酸钠抗冻效果

鲮鱼（Darce）主产于我国华南和西南水系中，是集良药与美食于一身的鱼类，其品味相当高雅，专家认为它“纤维多而幼，水分少而鲜，肉色白而嫩”，且鲮鱼具有生长快、养殖成本低、产量大的特点，但其缺点是个体小、细骨多，正常食用不方便，因此，将鲮鱼加工成鱼糜及鱼糜制品，是提高其经济价值和附加值的有效途径之一。鱼糜主要以冷冻鱼糜的形式出现，冷冻鱼糜是一种浓缩的高肌原纤维蛋白，经采肉、漂洗、脱水、加抗冻剂制得的糜状鱼肉。添加抗冻剂能防止鱼糜在冷冻过程中蛋白发生变性，并提高冷冻鱼糜的凝胶强度，目前工业上冷冻鱼糜主要采用的抗冻剂为4%蔗糖和4%山梨糖醇的混合物（称“商业抗冻剂”），这种复合抗冻剂虽然对鱼糜蛋白具有很好的抗冻效果，但甜度和热量较高，不符合“低甜、低热”的消费趋势，因而有必要研究开发新型低甜度、低热量抗冻剂。在国外，寡聚糖、乳糖醇以及麦芽糊精等［1-4］的抗冻效果已得到较为广泛的研究，而在国内对新型鱼糜抗冻剂的研究不多。海藻糖、聚葡萄糖和乳酸钠是多用途的食品添加剂，具有低热量、低甜度的特点，将它们作为抗冻剂应用于鱼糜之中的研究很少。为此，本文以海藻糖、聚葡萄糖和乳酸钠为抗冻剂，将其加入到鲮鱼鱼糜中，研究了这几种抗冻剂对鲮鱼鱼糜的抗冻效果，并将其抗冻效果与商业抗冻剂进行比较，为开发新型“低甜度、低热量”的鱼糜抗冻剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

鲮鱼鱼糜 由广东省南海食品进出口有限公司西樵食品厂提供；海藻糖（纯度≥98%） 购于广西南宁中诺生物工程有限责任公司；乳酸钠（浓度75%） 购于成都联合化工试剂研究所；聚葡萄糖（纯度≥94%） 购于广州展晨公司；液体山梨糖醇（食品级） 购于广州合诚化学有限公司；蔗糖等其它试剂 均为市售分析纯或生化级试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 将鲮鱼鱼糜均分成5份，一份不添加任何抗冻剂，作为对照样鱼糜，另4份分别加入8%海藻糖、8%聚葡萄糖、8%乳酸钠和8%商业抗冻剂。然后将上述5份鱼糜样品置于-18℃下贮藏26周，定期取样测定鱼糜的各项指标。

1.2.2 肌动球蛋白的提取 按文献［5］的方法，称取一定量的鱼糜，加入 10倍体积的冷 KCl溶液（0.6mol/L，pH7.0），低温均质后离心，收集清液并加入3倍体积的冷蒸馏水，离心后收集沉淀，然后加入适量冷KCl溶液（0.6mol/L，pH7.0）溶解沉淀，离心收集上清液即为肌动球蛋白溶液。

1.2.3 盐溶性蛋白测定 按文献［6］的方法，高离子磷酸盐缓冲液中蛋白质含量减去低离子磷酸盐缓冲液中蛋白质含量即为盐溶性蛋白质含量。

1.2.4 Ca2+-ATPase活性的测定 按文献［5］的方法，肌动球蛋白的Ca2+-ATPase活性以每毫克蛋白质在每分钟内生成的磷（Pi）的微摩尔数来表示，其单位为μmol Pi/（mg·min）。无机磷含量测定采用钼酸铵法测定［7］。

1.2.5 总巯基含量测定 按文献［5］的方法，其中测定波长为412nm，分子吸光系数取13600L/mol·cm，巯基含量以mol/105g蛋白计。

1.2.6 二硫键含量的测定 按文献［5］的方法，取0.1mL浓度为4mg/mL的肌动球蛋白溶液，加3mL的NTSB，混匀后在常温暗处放置25min，然后在412nm测吸光值。同时做一空白对照实验。

1.2.7 表面疏水性的测定 按文献［5］的方法，以1-苯奈氨-8磺酸（ANS）作为荧光探针，测定不同浓度肌动球蛋白在激发波长374nm、发射波长485nm条件下的荧光强度。表面疏水性以荧光强度与蛋白质浓度对应的曲线的斜率来表示。

1.2.8 鱼糜凝胶的制作 参考文献［8］的方法，鱼糜水分含量调至85%，采用二段加热法（40℃/30min和90℃/20min）加热后制成鱼糜凝胶。

1.2.9 鱼糜凝胶强度的测定 按文献［5］的方法，采用TA-XT2I/25质构仪先测定凝胶破断强度和凹陷深度，两者之积即凝胶强度（g·cm）（检测条件：圆柱压头直径5mm，压速1.3mm/s，施加重量为5kg）。

2 结果与讨论

2.1 抗冻剂对鲮鱼鱼糜盐溶性蛋白含量的影响

肌原纤维蛋白是盐溶性蛋白，在冻藏过程中，由于变性形成分子间氢键、疏水键、二硫键及盐键等，会导致其盐溶性下降［9］。由图1可见，所有样品盐溶性蛋白含量随冻藏时间的增加不断下降，对照样下降趋势最明显。冻藏26周后，对照样及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠、商业抗冻剂的样品盐溶性蛋白含量依次为19.6、53.3、52.5、53.9、53.3mg/g；对照样的盐溶性蛋白下降了80.5%，显著高于添加抗冻剂的样品（p＜0.05），而添加了抗冻剂的样品间盐溶性蛋白下降幅度差别较小（p＞0.05），约下降了47.8%。可见从盐溶性蛋白含量来看，三种新型抗冻剂具有与商业抗冻剂相当的抗冻效果。

图1 抗冻剂对鲮鱼鱼糜在-18℃冻藏中盐溶性蛋白含量的影响

2.2 抗冻剂对鲮鱼鱼糜蛋白Ca2+-ATPase活性的影响

Ca2+-ATPase活性是反映鱼糜肌球蛋白或肌动球蛋白中肌球蛋白部分结构完整性的重要指标，冻藏过程中肌球蛋白尤其是肌球蛋白头部的变性，会导致Ca2+-ATPase活性下降。图2表明，对照样冻藏0～12周，Ca2+-ATPase活性下降幅度为94.5%，到26周时活性仅为0.00067μmol Pi/（mg·min）；而加入抗冻剂的样品Ca2+-ATPase活性虽然整体上也呈下降趋势，但下降幅度比对照平缓很多，26周时添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠和商业抗冻剂的样品Ca2+-ATPase活性分别为 0.087、0.081、0.084、0.080μmol Pi/（mg·min），显著高于对照样（p＜0.05）；下降幅度依次为44.8%、47.7%、42.8%、45.9%，显著低于对照样（p＜0.05）。可见抗冻剂的添加能够防止鱼糜Ca2+-ATPase活性大幅下降，从而抑制鱼糜蛋白冷冻变性，其中海藻糖和乳酸钠抗冻效果比商业抗冻剂好，聚葡萄糖的抗冻效果略差于商业抗冻剂。

图2 抗冻剂对鲮鱼鱼糜在-18℃冻藏中Ca2+-APTase活性的影响

2.3 抗冻剂对鲮鱼鱼糜蛋白总巯基和二硫键含量的影响

由图3可见，随着冻藏时间的增加，所有样品的巯基含量整体上都呈下降趋势，以对照样的下降程度最大；冻藏26周后，对照样及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠和商业抗冻剂的样品巯基含量分别为1.54、2.38、2.31、2.37、2.34mol/105g蛋白，以对照样含量最低（p＜0.05），而添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠的样品与商业抗冻剂样品之间差别不显著（p＞0.05）。

图3 抗冻剂对鲮鱼鱼糜在-18℃冻藏中巯基含量的影响

图4表明，在冻藏过程中，所有样品的二硫键含量不断增加，在冻藏过程中鱼糜肌动球蛋白不断有二硫键形成。其中对照样二硫键含量增加最多，26周时，对照样及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠和商业抗冻剂的样品二硫键含量分别为：3.72、2.61、2.73、2.67、2.75 mol/106g蛋白，对照样显著高于添加抗冻剂的样品（p＜0.05）；二硫键增幅分别为176.6%、100.92%、110.62%、104.12%、110.07%，海藻糖、乳酸钠样品的下降幅度明显低于商业抗冻剂样品（p＜0.05），而聚葡萄糖和商业抗冻剂样品差别不明显（p＞0.05）。

图4 抗冻剂对鲮鱼鱼糜在-18℃冻藏过程中二硫键含量的影响

二硫键含量的增加与巯基含量的下降之间存在一定相关性，在冻藏过程中肌球蛋白分子的变性尤其是结构的改变可能导致了一些活性巯基的暴露，这些暴露的活性巯基发生氧化引起二硫键含量增加［10］。由实验结果可见，加入抗冻剂可以有效防止巯基的氧化，进而抑制二硫键的生成，起到保护巯基、防止蛋白质变性的作用，其中海藻糖、乳酸钠的抑制效果比商业抗冻剂好，聚葡萄糖的抑制效果和商业抗冻剂相当。

2.4 抗冻剂对鲮鱼鱼糜蛋白表面疏水性的影响

新鲜鱼糜蛋白的疏水性氨基酸残基一般位于蛋白质分子内部，具有较低的表面疏水性，而在冻藏过程中，蛋白质可因变性而发生构型转化，使原先位于蛋白质分子内部的疏水性氨基酸残基暴露，导致蛋白质表面疏水性增加［11］。图5表明，在冻藏的0～26周，随着冻藏时间的延长，对照样品肌动球蛋白的表面疏水性呈明显的上升趋势，而添加抗冻剂的样品表面疏水性虽在冻藏过程中也呈上升趋势，但比对照样上升缓慢。26周时，对照样及添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠、商业抗冻剂的样品表面疏水性分别为90.4、78.7、81.3、83.1、81.0，上升率依次是 47.8%、32.8%、37.9%、40.9%、37.0%，其中对照样表面疏水性及其增幅显著高于添加抗冻剂的样品（p＜0.05），而乳酸钠、海藻糖与商业抗冻剂区别显著（p＜0.05），聚葡萄糖与商业抗冻剂区别不显著（p＞0.05）。实验结果说明，添加抗冻剂能防止鱼糜蛋白质变性，保护蛋白质内部疏水性氨基酸残基。从抑制鱼糜蛋白表面疏水性增加来看，海藻糖的抗冻效果强于商业抗冻剂，聚葡萄糖的抗冻效果和商业抗冻剂相当，乳酸钠的抗冻效果稍逊于商业抗冻剂。

图5 抗冻剂对鲮鱼鱼糜在-18℃冻藏中表面疏水性的影响

2.5 抗冻剂对鲮鱼鱼糜蛋白凝胶强度的影响

凝胶能力是反映鱼糜蛋白冷冻变性的最直观的指标。图6表明，随着冻藏时间的延长，所有样品的凝胶强度均有所下降，对照样相对添加抗冻剂的样品，凝胶强度下降更显著（p＜0.05）。冻藏26周后，对照样的凝胶强度只有280.20g·cm，比新鲜鱼糜下降了61.6%，而添加海藻糖、聚葡萄糖、乳酸钠、商业抗冻剂的鱼糜凝胶强度分别为 486.94、477.04、415.82、411.33g·cm，海藻糖、聚葡萄糖样品明显高于商业抗冻剂样品（p＜0.05），而乳酸钠和商业抗冻剂样品差别不显著（p＞0.05）；四种样品凝胶强度下降幅度依次为35.69%、37.78%、44.02%、45.52%，其中海藻糖、聚葡萄糖样品和商业抗冻剂样品有显著差别（p＜0.05），而乳酸钠和商业抗冻剂样品差别不显著（p＞0.05）。可见，从凝胶强度来看，海藻糖、聚葡萄糖对鲮鱼鱼糜的抗冻效果均强于商业抗冻剂，而乳酸钠的抗冻效果和商业抗冻剂相当。

图6 抗冻剂对鲮鱼鱼糜在-18℃冻藏过程中凝胶强度的影响

3 结论

海藻糖、乳酸钠、聚葡萄糖对在-18℃冻藏的鲮鱼鱼糜蛋白的冷冻变性具有较好的抑制作用，其中乳酸钠的抗冻效果与传统的商业抗冻剂相比具有一定的优势，表现在它比商业抗冻剂更好地抑制鲮鱼鱼糜盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巯基含量和凝胶强度的下降，并防止鱼糜蛋白表面疏水性及二硫键的增加；海藻糖的抗冻效果也优于传统商业抗冻剂，其抑制二硫键的增加及维持鱼糜盐溶性蛋白含量、Ca2+-ATPase活性、巯基含量和凝胶强度的能力均强于商业抗冻剂；聚葡萄糖的抗冻效果与商业抗冻剂相当，其在抑制鲮鱼鱼糜盐溶性蛋白含量、巯基含量、凝胶强度的下降及二硫键、表面疏水性的增加方面的能力均与传统商业抗冻剂相当。

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Study on cryoprotective effects of some new cryoprotectants on darce surimi during frozen storage

ZHOU Ai-mei，GONG Cui，CAO Huan，GUO Wei-jie，LIU Xin，CHEN Yong-quan
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The cryoprotective effects of trehalose，polydextrose，and sodium lactate at level of 8%（w/w）in darce surimi were studied in comparison with a conventional cryoprotectan（t4%sucrose+4%sorbitol）during extended storage at-18℃ for up to 26 weeks using salt extractable protein（SEP），Ca2+-ATPase activity，total sulfhydryl content，disulfide bond content，surface hydrophobicity and gel strength as indicators.The results indicated that the addition of trehalose，polydextrose and sodium lactate could all retard the protein denaturation of frozen darce surimi and the cryoprotective effect of sodium lactate was superior to that of commercial cryoprotectant as evidenced by lowered decrease in SEP，Ca2+-ATPase activity，total sulfhydryl content and gel-forming ability as well as the impeded increase in surface hydrophobicity and disulfide bond content.Also，the cryoprotective effect of trehalose was better than that of commercial cryoprotectant as indicated by its better ability of inhibiting the increase of disulfide bond and its better ability of maintaining SEP，Ca2+-ATPase activity，total sulfhydryl content and gel-strength.The cryoprotective effect of polydextrose was comparable to that of commercial cryoprotectant as shown by its comparable ability of retarding the decrease of SEP，total sulfhydryl content and gel-strength and its comparable ability of inhibiting the increase of disulfide bond and surface hydrophobicity.Therefore，owing to their low sweetness and calorie，the above three substances appeared to be promising alternative cryoprotectants of the conventional cryoprotectant with high sweetness and calorie in surimi industry.

darce surimi；trehalose；polydextrose；sodium lactate；cryoprotective effects

TS254.4

A

1002-0306（2010）10-0318-04

2009-09-25

周爱梅（1971-），女，博士，副教授，主要从事食品化学及水产品加工研究。

广东省科技计划项目（2003C50203）。