陈易彬,马小燕

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安 710021)

中国大鲵可溶性蛋白制备及SDS-PAGE电泳分析

陈易彬,马小燕＊

(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安 710021)

采用超声法制备大鲵可溶性蛋白质;从提取温度、时间、液料比方面确定适宜的工艺参数,并对所得可溶性蛋白的分子量进行研究。均匀设计实验结果表明:在提取温度为 45℃、提取时间为 30min、液料比为 10∶1时,大鲵可溶性蛋白溶出量最多,达 63.57mg/g。SDS-PAGE电泳分析可溶性蛋白的组成表明,大鲵可溶性蛋白亚基分布广泛,分子量低,易于消化吸收,为优质的营养蛋白。

大鲵可溶性蛋白,SDS-PAGE电泳

中国大鲵 (Andrias davidianus),俗称“娃娃鱼”[1],肉质鲜美,含有优质的蛋白质和丰富的氨基酸、微量元素,经常食用可以聪明益智、延缓衰老、提高造血和免疫功能,对防止心脑血管系统、恶性贫血和恶性肿瘤有很好的作用[2]。近年来,随着人工驯养和繁殖技术的发展,大鲵产量大增,其食用和药用价值也引起人们越来越多的重视。本工作采用超声法制备大鲵可溶性蛋白,考察提取温度、时间及液料比对制备效果的影响,确定其适宜的工艺参数,并对可溶性蛋白的分子量进行研究,为大鲵资源的进一步研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

大鲵 实验室提供;牛血清标准蛋白 北京奥博星生物技术有限责任公司;考马斯亮蓝 G-250 天津市科密欧化学试剂开发中心;低分子量标准蛋白 香港昊柏技术有限公司;其它试剂 均为分析纯。

K Q-200K DE型可调数控超声仪 昆山市超声仪器有限公司;UV-1800紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;DDY-10Cz型电泳仪、DYCZ-22A垂直板电泳槽 北京六一仪器厂;Bandscan 5.0软件。

1.2 实验方法

1.2.1 超声法制备大鲵鱼肉中的可溶性蛋白

1.2.1.1 工艺流程 低温取样→加提取液研磨→超声提取→离心→收集上清液→低温储藏[3]

1.2.1.2 单因素考察 分别以不同提取温度、时间及液料比做单因素实验,考察单因素对可溶性蛋白含量的影响。

1.2.1.3 均匀设计实验 在单因素实验基础上,确定均匀设计实验因素与水平[4]。以可溶性蛋白含量为指标,对大鲵可溶性蛋白的制备工艺条件进行优化。

1.2.2 大鲵可溶性蛋白的 SDS-PAGE电泳 采用15%分离胶、5%浓缩胶对可溶性蛋白进行 SDSPAGE电泳分析[5]。拍照并用 Bandscan5.0软件分析。

1.2.3 可溶性蛋白含量测定 采用 Bradford法测定可溶性蛋白含量[6]。

1.2.4 蛋白质分子量的测定 在 Laemmli[7]方法中,蛋白质分子量的对数 (lg)与其相对迁移率呈良好的线性关系,因此,以标准蛋白质的分子量对迁移率作图,得标准曲线。根据未知蛋白的迁移率,从标准曲线中查出其分子量。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

配制最终浓度为 0、20、40、60、70、80、100μg/mL的标准蛋白质溶液,各取标准液 1mL,加入考马斯亮蓝 5mL,混合反应 2min后,在 595nm波长下比色测定吸光度,以蛋白质含量(μg)为横坐标,以吸光度为纵坐标,得到的标准曲线方程为 y=0.005x+0.011, R2=0.998,线性范围为 10～100μg/mL。

2.2 单因素对超声法制备大鲵可溶性蛋白的影响

2.2.1 提取温度的影响 在时间为 30min,液料比为10∶1的条件下,不同提取温度对可溶性蛋白溶出量的影响如图 1所示。

图 1 提取温度对提取效果的影响

由图 1可以看出,当温度低于 30℃时,蛋白质溶出量增加趋势平坦;从 30℃开始蛋白质溶出量增加趋势变得显著;超过 45℃后,蛋白质溶出量开始下降。因此,45℃是提取可溶性蛋白质的适宜温度。

2.2.2 提取时间的影响 在温度为 45℃,液料比为10∶1条件下,不同作用时间对可溶性蛋白溶出量的影响如图 2所示。

图 2 提取时间对提取效果的影响

从图 2可以看出,提取时间为 30min时,可溶性蛋白溶出量最多;提取时间低于 30min时,随着提取时间的延长,可溶性蛋白溶出量增多,当到达 30min后,可溶性蛋白溶出量反而降低。因此,提取时间为30min为宜。

2.2.3 液料比的影响 在提取时间为 30min,提取温度为 45℃条件下,不同液料比对可溶性蛋白溶出量的影响如图 3所示。

从图 3可以看出,可溶性蛋白溶出量随液料比增加而迅速增加,在液料比 10∶1以上时,可溶性蛋白溶出量增加缓慢。因此,液料比选择 10∶1较为合适。

2.3 均匀设计实验优化结果

图 3 液料比对提取效果的影响

根据单因素实验结果,分别以提取温度、提取时间、液料比为影响因素,以可溶性蛋白溶出量为指标,选择3因素5水平的均匀设计实验,实验结果见表1。

表 1 均匀实验设计和实验结果

将表 1得到的实验结果进行逐步回归分析[8],得到回归方程为:Y=45.7+0.441X1+0.264X2-0.931X3,复相关系数 r=0.9973。由以上方程可以看出:液料比对制备效果影响最大,且液料比越大,制备效果越差。其次为超声温度;超声时间对制备效果影响最小。由此得出最佳超声制备方案为:温度 45℃,时间30min,液料比为 10∶1。

2.4 大鲵可溶性蛋白质的 SDS-PAGE电泳

采用 15%分离胶、5%浓缩胶对大鲵可溶性蛋白质进行 SDS-PAGE分析,用相机拍照并用Bandscan5.0软件分析所得到的电泳图谱如图 4所示。

图 4 大鲵可溶性蛋白的 SDS-PAGE电泳图谱

对大鲵可溶性蛋白质进行 S DS-PAGE电泳分析图谱显示,大鲵可溶性蛋白质亚基分子量位于 121～5kDa范围内,共有 14条带,分子量分别为 121、93、78、67、41、35、29、19、18、14、12、9、6、5kDa,皆为低分子量的蛋白。其中分子量为 41kDa的蛋白含量最多,分子量为 35kDa和 93kDa的蛋白含量也较多。

3 结论

3.1 通过对影响大鲵蛋白溶出量的超声提取时间、提取温度和液料比进行了均匀设计实验,结果表明:液料比对蛋白溶出量的影响最大,其次为温度和时间。最佳制备工艺条件为:提取温度 45℃,时间30min,液料比为 10∶1。

3.2 SDS-PAGE电泳图谱显示,大鲵可溶性蛋白组分种类较多,营养价值高,其分子量较小,有利于人体对蛋白质的消化吸收,是一种优质的营养蛋白。

[1]中国野生动物保护协会,费梁 .中国两栖动物图鉴[M].郑州:河南科学技术出版社,1999:38-40.

[2]高士贤,戴定远,范勤德 .常见药用动物[M].上海:上海科技出版社,1984:14.

[3]乔志刚,等 .中国大鲵消化系统 13种器官的蛋白水解酶种类和活性分析[J].动物学报,2003,49(4):537-539.

[4]方开泰 .均匀设计与均匀设计表[M].北京:科学出版社, 1994:25-78.

[5]郭尧君 .蛋白质电泳实验技术 [M].北京:科学出版社, 1999:112-158.

[6]余冰宾 .生物化学实验指导[M].北京:清华大学出版社, 2004:136-138.

[7]Laemmli K.Cleavage ofstructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227 (259):680-685.

Preparation and SDS-PAGE analysis of soluble protein of Andrias davidianus

CHEN Y i-b in,MA Xiao-yan＊
(College ofLife Science and Engineering,ShaanxiUniversity of Science and Technology,Xi’an 710021,China)

U ltrasonic m e thod was used to extrac t the solub le p rote ins of And rias david ianus,and w ith a s imp le fac tor exp e r im ent and a uniform des ign,the p rep a ra tion p rocedures we re inves tiga ted.The results showed tha t the op t im a l extrac tion temp e ra ture,t im e,and the ra tio ofwa te r to m a te ria lwe re45℃,30m in and10∶1,resp ec tive ly,and the content of solub le p rote ins in And rias dab id ianus could reach63.57m g/g.SDS-PAGE ana lys is showed tha t the subunitm olecula rwe ight of solub le p rote ins was in a w ide range,which we re a lso low and easy to be absorbed.

And rias david ianus solub le p rote in;SDS-PAGE

TS254.1

A

1002-0306(2010)04-0296-03

2009-05-12 ＊通讯联系人

陈易彬 (1955-),男,本科,副教授,研究方向:天然产物的分离与修饰。