周才琼,李艳芳,杜木英

(西南大学食品科学学院特色食品工程技术研究中心,重庆 400716)

渝黔她区传统酸肉发酵过程中微生物区系研究

周才琼,李艳芳,杜木英＊

(西南大学食品科学学院特色食品工程技术研究中心,重庆 400716)

目的:对渝黔地区传统酸肉微生物种群进行研究。方法:采用不同的选择培养基对微生物进行分离鉴定和计数。结果:从中分离出乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌和微球菌,未发现霉菌。乳酸菌优势菌群主要是片球菌属和乳杆菌属,鉴定 12株乳酸菌分别为乳酸链球菌、肠膜明串珠菌、类肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、米酒乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、约氏乳杆菌、嗜盐片球菌和啤酒片球菌;优势菌株戊糖片球菌、植物乳杆菌贯穿整个发酵过程。葡萄球菌主要是表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌,其中木糖葡萄球菌为主要发酵菌株。酵母菌主要为汉逊酵母属、接合酵母属、毕赤氏酵母和德巴利酵母属等,鲁氏接合酵母为优势发酵菌株。结论:优势微生物是酸肉风味品质形成的基础,本研究可为高效天然肉制品发酵剂的研究提供生物资源。

发酵酸肉,微生物区系

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜猪肉、原辅料 均为市售,糯米炒至金黄磨粉备用;细菌计数 采用牛肉膏蛋白胨培养基;乳酸菌计数、分离与纯培养培养基 采用MRS培养基;微球菌和葡萄球菌计数与纯培养 采用甘露糖高盐琼脂MSA;酵母菌计数与纯培养 采用改良 PDA培养基。

S W-CJ-1FD超净工作台,XSP-C生物显微镜, JLQ-S1菌落计数器,HH-6数显恒水浴锅,JA2003A电子天平,电热恒温培养箱 HH-B11等。

表 1 乳酸菌的初步鉴定表

1.2 实验方法

1.2.1 酸肉发酵工艺 采用渝黔苗汉杂居地区传统酸肉生产工艺。将新鲜猪肉洗净,沥去多余水分,切成约3cm×5cm片状,加5%食盐和 10%炒米粉揉制均匀后装坛,水密封,10～20℃发酵。

1.2.2 取样方法 按 GB/T 4789.17-2003进行。

1.2.3 菌落计数[4]细菌及乳酸菌计数采用 37℃恒温培养 48h;酵母菌采用 28℃恒温培养 48h;微球菌和葡萄球菌计数采用 30℃恒温培养 48h。

1.2.4 微生物鉴定[5-7]细菌鉴定采用形态观察、革兰氏染色、生理生化及生态特性鉴定;酵母菌鉴定指标包括菌落特征观察,结合糖发酵实验、碳源同化实验等。

2 结果与分析

2.1 酸肉发酵中微生物的消长变化

经测定酸肉发酵过程中微生物数量变化,结果见图 1。由图 1可知,细菌总数和乳酸菌数在发酵过程中先升后降,高峰值分别出现在发酵 20d和 30d,菌数的对数值 (log cfu/g)分别为 8.61和 8.94,酵母菌数 log cfu/g稳定在 6.14;微球菌和葡萄球菌呈下降趋势,至发酵 60d时,其总数仅为发酵 0d的 49.12%,丝状真菌未检出。可能的原因是发酵初期由于原料和一定缺氧环境,适合多种微生物生长,随乳酸菌产酸、氧气减少、细菌素产生,使耗氧菌、不耐酸细菌和腐败菌生长受抑制。

图 1 发酵过程中的微生物变化

2.2 微生物鉴定结果

2.2.1 乳酸菌的鉴定 在发酵各阶段样品中经MRS培养基分离纯化后进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验,共得到 12种革兰氏染色阳性,过氧化氢酶阴性的菌株,如表 1所示进行初步鉴定,这 12株菌株分别属于乳杆菌属、链球菌属、明串珠菌属和片球菌属共4个属。

从表 1可知,分离出来的乳酸菌中,第一优势乳酸菌为片球菌属,占 41.67%;其次是乳杆菌属,占33.33%。链球菌属,明串珠菌属分别为 8.33%和16.67%。进一步生理生化实验结果如表 2。对照《伯杰氏细菌鉴定手册》确定,1号为乳酸链球菌,2号为肠膜明串珠菌,3号为类肠膜明串珠菌,4号、9号为植物乳杆菌,5号为米酒乳杆菌,6号为乳酸片球菌,7号、11号为戊糖片球菌,8号为约氏乳杆菌, 10号为嗜盐片球菌,12号为啤酒片球菌。其中的优势菌为植物乳杆菌和戊糖片球菌,其显微摄影见图2。

图 2 菌株 9号、11号的形态特征(10×100)

表 3 微球菌及葡萄球菌的鉴定

2.2.2 微球菌及葡萄球菌鉴定 在发酵各阶段,分别从由红变黄的MSA培养基上,选取菌落形态不同数量最多菌株进一步作平板划线纯化,分离出 6种优势菌,主要属于葡萄球菌,占 83.33%,微球菌只占16.67%,见表 3。结合表 4生理生化实验结果。对照《伯杰氏细菌鉴定手册》确定,B-1-1号为里拉微球菌,B-2-2号为表皮葡萄球菌,B-2-3号为腐生葡萄球菌,B-2-4号为木糖葡萄球菌,B-2-5号为肉葡萄球菌,B-2-6号为木糖葡萄球菌。其中,木糖葡萄球菌为绝对优势菌株,B-2-6号革兰氏染色形态如图3。

表 2 乳酸菌(来自MRS)鉴定实验结果

表 5 酵母的菌落形态和细胞形态

2.2.3 酵母菌鉴定 结合表 5的酵母属的形态学特征和表 6所示的一些生理生化特征,初步将酵母鉴定到6个属。YA类共7株,占总数的17.5%,初步鉴定为汉逊酵母属;YB类共12株,占总数的 30.0%,初步鉴定为接合酵母属;YC类 1株,初步鉴定为毕赤酵母;YD类共 16株,占总数的 40.0%,初步鉴定为德巴利酵母属;YE类共 4株,占总数的 10.0%,初步鉴定为假丝酵母属。

图 3 B-2-6号细菌显微形态特征 (10×100)

表 4 微球菌及葡萄球菌(来自MSA)鉴定的生理生化实验结果

生理生化实验结果见表 7～表 10。根据上述结果,查阅《酵母菌鉴定手册》,YA-2等 7株为霍尔斯汉逊酵母,YB-8号等 12株为鲁氏接合酵母,YC-1号为卡森毕赤氏酵母,YD-4号等 9株为汉逊德巴利酵母,YD-12号等 7株为多形德巴利酵母,YE-3号等 4株为类筒假丝酵母。优势菌株为鲁氏接合酵母,其中 YB-8号美兰染色的菌体形态见图 4。

图 4 YB-8号酵母菌显微形态特征(10×40)

表 6 酵母菌属的鉴定结果

表 7 糖醇发酵实验

表 8 同化碳源实验

表 9 同化氮源实验

3 讨论与结论

采用重庆、贵州苗汉杂居地区的酸肉加工工艺加工酸肉,在对发酵过程中微生物数量、种类进行研究后发现,渝黔地区酸肉发酵过程中微生物种类主要有乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌和微球菌,未发现霉菌。乳酸菌优势菌群主要是片球菌属和乳杆菌属,共鉴定了 12株,分别是乳酸链球菌、肠膜明串珠菌、类肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、米酒乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、约氏乳杆菌、嗜盐片球菌和啤酒片球菌。优势菌株戊糖片球菌,植物乳杆菌贯穿整个发酵过程。葡萄球菌主要是表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌,其中木糖葡萄球菌为主要发酵菌株。酵母菌主要为霍尔巴利酵母、鲁氏接合酵母、毕赤氏酵母和德巴利酵母属等,而鲁氏接合酵母为优势发酵菌株。微球菌主要是里拉微球菌。

表10 其他实验

有资料报道发酵肉制品中出现大量乳酸菌[1,8-10]。本实验研究结果与文献报道一致。其中,酸肉发酵前期出现较多明串珠菌,后期出现戊糖片球菌,与李宗军的报道相同[10]。

本实验与文献报道不同之处:一是本实验研究中明串珠菌和戊糖片球菌峰值出现时间提前,在数量上也较低;二是本研究优势菌群是戊糖片球菌和植物乳杆菌,而不是李宗军所报道的乳酸杆菌;三是酵母菌、微球菌、葡萄球菌的变化与以往研究出入较大,其中,微球菌和葡萄球菌数量的消长变化与李宗军的报道相反;四是肉制品中出现大量的木糖葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌,有文献报道,这些菌类可分泌胞外酶,有脂肪酶和蛋白酶活性[11],推测是发酵肉制品风味形成的原因。发生这些差异的原因可能与微生态环境、发酵工艺以及原料来源不同有关。

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Study on m icrobial flora of traditional ferm entative sourm eat in YU-Q I AN district

ZHOU Ca i-qiong,L IYan-fang,DUM u-ying＊
(Engineering&Technology Research Central of Characteristic Food,Food Science College, SouthwestUniversity,Chongqing 400716,China)

O b jec tive:To inves tiga te the m ic rob ia l flora of trad itiona l fe rm enta tive sour m ea t of Y U-Q I AN d is tric t. M e thods:The m ic roorganism s we re sep a ra ted and enum e ra ted by d iffe rent se lec tive m ed ia.Results:The lac tic ac id bac te ria(LAB),yeas t,s tap hylococcus and m ic rococcus bac te ria we re isola ted from fe rm enta tive sour m ea t but no m oulds we re isola ted.The dom inant genus of lac tic ac id bac te ria we re Ped iococcus and Lac tobac illus. Twe lve LAB we re identified as S.lac tis,L.m esente roides,L.p a ram esente roides,L.p lanta rum,L.sake,P.ac id ia lac tic i, P.p entosaceus,L.johnsonii,P.ha lop hilus and P.ce revis iae,resp ec itive ly.Am ong them,P.p entosaceus and L.p lanta rum we re p redom inant s tra ins during the whole fe rm enta tion.S tap hylococcus m a inly inc luded S.ep ide rm id is,S.sa rop hyticus,S.xylosus and S.ca rnosus,while S.xylosus was the m a in fe rm entive S tap hylococcus. Yeas tsm a inly inc luded Hansenula,Zygosaccha rom yces,Pichia as we llas Deba ryom yces genus,and Zygosaccha rom yces rouxiiwas the sup e rior fe rm entive yeas t.Conc lus ion:The sup e riorm ic roorganism s form ed the base of sp ec ia l flavour of fe rm enta tive sour m ea t.This inves tiga tion p rovided b io-resources for s tudying and exp loiting na tura lm ea t s ta rte rs.

fe rm enta tive sourm ea t;m ic roorganism

TS201.3

A

1002-0306(2010)04-0171-05

酸肉是西南地区少数民族喜爱的一种民间发酵肉制品,特别是苗族和侗族。不同地域、不同民族,酸肉腌制方法有所不同,对于侗族传统酸肉微生物区系及品质研究已有相关报道[1-2]。本实验采用重庆、贵州苗汉杂居地区酸肉加工工艺制作酸肉,并对酸肉发酵过程中生态环境与微生物菌群的关系进行了初步研究。

2009-03-26 ＊通讯联系人

周才琼 (1964-),女,教授,主要从事食品营养化学有关教学与科研工作。

重庆市教委应用基础研究资助项目(070203)。