张 恺, 薛 娜, 李 林, 李 凡, 杜玉民＊

(1.河北医科大学药学院,河北石家庄050017;2.河北化工医药职业技术学院,河北石家庄050026)

高效液相色谱手性固定相法拆分阿折地平对映体

张 恺1, 薛 娜2, 李 林1, 李 凡1, 杜玉民1＊

(1.河北医科大学药学院,河北石家庄050017;2.河北化工医药职业技术学院,河北石家庄050026)

建立了阿折地平对映体的高效液相色谱拆分方法。采用Chiralpak AD-H(250mm×4.6mm,5.0μm,D aicel公司)手性色谱柱在正相条件下直接拆分阿折地平对映体,考察了固定相种类、流动相组成及柱温等对阿折地平对映体分离的影响。确定了最佳的拆分条件:流动相为正己烷-异丙醇(90∶10,v/v),流速为0.8mL/m in,检测波长为254nm;柱温为20℃;在此条件下阿折地平对映体的分离度为3.3。该法简单快速,重现性好。

高效液相色谱法;手性固定相;手性拆分;阿折地平

Abstract:A high performance liquid Chromatographic(HPLC)method was established for the enantiomeric separation of azelnidipine.Baseline chiral separation of azelnidipine was achieved under normal-phase Chromatographic mode using the Chiralpak AD-H chiral column(250mm×4.6mm,5.0μm,Daicel).The influences of the nature of chiral stationary phase,form of the mobile phase,and column temperature on the enantiomeric separation were studied.The optimized Chromatographic conditions were hexane-isopropyl alcohol(90∶10,v/v)as the mobile phase with a flow rate of0.8mL/m in and detection at the wavelength of254nm.The column temperature was set at20℃.The resolution of3.3for azelnidipine was achieved under the above Chromatographic conditions.The method is simple,rap id and with good rep roducibility.

Key words:high performance liquid Chromatography(HPLC);chiral stationary phase;chiral sp lit;azelnidipine

阿折地平(azelnidipine)是由日本三共制药研发,2003年上市的一种新型的长效钙拮抗剂,结构属于1,4-二氢吡啶类化合物[1],可以选择性阻滞L型钙通道,适用于缓解心衰和高血压等症状。由于其药效作用迅速,副作用小,所以是一种非常具有开发前途的抗高血压药物[2]。

目前应用于临床的阿折地平为外消旋体[3],其分子结构中1,4-二氢吡啶环的4位碳原子为一个手性中心(见图1),具有R、S型两个对映异构体。据报道,阿折地平对映体中,R体具有活性,S体无活性[4],并且此类药物中已有左旋氨氯地平作为氨氯地平的替代产品成功上市[5],因此,研究阿折地平的手性拆分方法对其安全用药和新药研发具有重要意义。Kiyoshi等[6]采用液相色谱-质谱联用的方法测定了人血浆中的阿折地平对映体,该方法灵敏度高,适用于血浆样品的分析。为了直接拆分阿折地平对映体,我们采用Chiralpak AD-H手性色谱柱,以正己烷-异丙醇(90∶10,v/v)为流动相,结果显示该方法对阿折地平对映体的分离度良好,简便、快速、实用性强。

图1 阿折地平的结构Fig.1 S tructu re of aze ln id ip ine

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

W aters高效液相色谱仪515泵和2487紫外检测器(W aters公司,美国),浙江大学N2000色谱工作站。阿折地平对照品(消旋体,纯度99.46%),河北医科大学药物化学实验室提供;正己烷、异丙醇均为色谱纯,购于迪马公司。

1.2 阿折地平供试品溶液的配制

取阿折地平对照品适量,精密称定,用流动相正己烷-异丙醇(90∶10,v/v)溶解并稀释配制成0.1 m g/mL的溶液,过0.45μm微孔滤膜过滤。

1.3 色谱条件

Chiralpak AD-H手性固定相色谱柱(250mm×4.6mm,5.0μm,D aicel公司);流动相:正己烷-异丙醇(90∶10,v/v);流速:0.8mL/m in;检测波长:254nm;柱温:20℃;进样量:20μL。

1.4 系统适应性试验

取供试品溶液,以直链淀粉氨基甲酸酯为填充剂,以正己烷-异丙醇(90∶10,v/v)为流动相,检测波长为254nm,记录色谱图,计算2个对映体的分离度。

2 结果与讨论

2.1 手性固定相的选择

我们分别用Chiralcel OD-R和Chiralpak ADH手性色谱柱进行了试验,采用Chiralcel OD-R手性色谱柱,以乙腈-水为流动相,无法使两个对映体达到基线分离。采用Chiralpak AD-H手性色谱柱,通过选择与优化,最终确定流动相为正己烷-异丙醇(90∶10,v/v),阿折地平异构体达到了良好分离。Chiralpak AD-H为直链淀粉氨基甲酸酯类手性固定相,直链淀粉是D-葡萄糖以α-1,4-糖苷键相连而形成的线形聚合物[7]。该类手性柱应用广泛,尤其适用于含酰胺基、芳香基、羰基、羟基和羧酸基等基团的手性化合物的拆分。

2.2 流动相组成对阿折地平对映体分离的影响

通常,在以二元混合溶剂体系为流动相的正相色谱分离模式中,随着流动相中极性组分的不断减少,对映体分离因子值逐渐增大,分离因子值与流动相组成关系曲线一般呈线性[8]。本实验以正己烷-异丙醇为流动相,考察了正己烷-异丙醇的比例对对映体分离的影响,结果见表1。可以看出,流动相中异丙醇的含量对阿折地平的保留时间影响较大;随着异丙醇比例的增大,不但使流动相极性增强,而且它与固定相之间的氢键作用抑制了对映体与固定相之间的相互作用,从而使对映体的保留时间明显缩短,分离度也随之下降。另外,随着异丙醇含量的增加,它与对映体分子竞争作用于固定相手性位点的强度也相应增强,从而可能会导致对映体分离因子的降低。但本实验中发现随着异丙醇比例的减小,分离因子并非一直增大,而是出现了拐点,这说明在该正相色谱分离体系中,流动相中的极性组分异丙醇以一种较为特殊的方式竞争与手性固定相分子或溶质对映体分子之间形成氢键。因此,我们综合考虑分离时间和分离效果,选择正己烷与异丙醇的最佳体积比为90∶10,在该流动相配比条件下对映体分离效果良好。

表1 异丙醇含量对分离的影响Table1 Effects of isopropy lalcohol con ten t on the enantiomeric separation

2.3 柱温对分离的影响

温度对高效液相色谱分离不同手性化合物的影响不尽相同。一般而言,对映体分离的Van’t Hoff曲线呈线性。低温条件下,对映体与手性固定相形成的络合物比高温度时稳定,有利于提高分离因子。柱温升高,使得溶质与固定相之间的结合能力减弱,保留时间变短,分离度变差。本实验在上述色谱条件下,考察了柱温在20～35℃范围内变化对手性分离的影响,结果见表2。由表2可以看出,随着分离温度的升高,保留因子减少,样品保留时间减少,分离因子和分离度大体上也是相应减少的,Van’t Hoff曲线基本呈线性,这说明阿折地平对映体在该手性固定相上的保留行为随色谱分离温度的变化而改变,手性分离过程受吸附反应热影响。因此20℃为最佳柱温。

表2 柱温对分离的影响Table2 Effects of columntem perature on the enantiomeric separation

2.4 重现性

在优化的色谱条件下,连续进样6次,阿折地平对映体出峰时间的相对标准偏差(RSD)分别为0.23%和0.46%,峰面积的RSD分别为1.4%和1.9%。实验结果表明,该方法简单、快速、重现性好,可用于阿折地平对映体的手性分离。

2.5 系统适应性试验

典型的系统适应性试验色谱图见图2,阿折地平对映体的分离度为3.3。

图2 阿折地平对映体的分离色谱图Fig.2 Chromatogram of azelnidipineenan tiomers

3 结语

本文采用Chiralpak AD-H手性色谱柱,在正相色谱分离条件下成功地拆分了阿折地平对映体,分离度达3.3。方法方便快速,为阿折地平对映体的进一步研究提供了有效的分离手段。由于应用化学方法还未拆分出阿折地平单一对映体,因此今后还需要更深入的研究,进一步考察对实际样品分析检测的可行性,证明本方法的实用性。

[1] Zhang K,Xue N,Du YM,et al.Chinese Journal of Pharm aceuticals(张恺,薛娜,杜玉民,等.中国医药工业杂志),2008,39(3):163

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[3] Chen A H,Wu R,Tao X.Chinese Journal of New D rugs and Clinical Rem edies(陈爱华,邬蓉,陶霞.中国新药与临床杂志),2006,25(12):946

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[5] Huang Z Y.Chinese Journal ofNew D rugs and Clinical Remedies(黄仲义.中国新药与临床杂志),2008,27(3):236

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[7] D ing L.Chromatographic Analysis for D rugs.Beijing:Peop le’s M edical Publishing House(丁黎.药物色谱分析.北京:人民卫生出版社),2008

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Enantiomeric separation of azelnidipine by high performance liquid chromatography with chiral stationary phase

ZHANG Kai1,XU E N a2,L I L in1,L I Fan1,DU Yum in1＊
(1.School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;2.Heibei Chemical and Pharmaceutical College,Shijiazhuang 050026,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0215-03

＊通讯联系人:杜玉民,教授,从事药物合成研究.Tel:(0311)86265624,E-m ail:yum indu@yahoo.com.cn.

2009-07-08

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00215