安美忱, 刘 宁

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030)

高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱分离鉴定牛乳铁蛋白素

安美忱, 刘 宁＊

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨150030)

建立了高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALD I-TO F/TO F MS)分离鉴定牛乳铁蛋白素(bovine lactoferricin,Lfcin B)的方法。采用胃蛋白酶酶解牛乳铁蛋白,酶解液离心后取上清液,经过离子交换色谱、反相液相色谱、透析等技术分离,对分离得到的目标产物进行抗菌活性分析、蛋白含量测定和MALD ITOF/TO F MS鉴定。分离得到高活性的LfcinB,其相对分子质量为3 124.89,蛋白含量为18.20μg/mL。本方法具有精度高、分析速度快和分辨能力强等优点,是其他传统的分析鉴定LfcinB方法所无法比拟的,为进一步研究LfcinB奠定了基础。

高效液相色谱;基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱;牛乳铁蛋白素;牛乳铁蛋白

Abstract:A high performance liquid Chromatography-matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/time of flight mass spectrometry(HPLC-MALD I-TO F/TO F MS)method was developed for the separation and identification of bovine lactoferricin(LfcinB).Bovine lactoferrin was hydrolyzed by pepsin and then separated by ion exchange Chromatography and reversed-phase liquid Chromatography(RP-LC).The antibacterial activities of the fractions from RP-LC separation were determined and the protein concentration of the fraction with the highest activity was measured,whose sequence was indentified by MALD I-TO F/TO F MS.The relative molecular mass of LfcinB was3 124.89and the protein concentration was18.20μg/mL.The method of producing LfcinB proposed in this study has fast speed,high accuracy and high resolution.

Key words:high performance liquid Chromatography(HPLC);matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/time of flight massspectrometry(MALD I-TO F/TO F MS);bovine lactoferricin;bovine lactoferrin

牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin)是富含在牛初乳中的一种功能因子,是转铁蛋白家族中一种天然的铁离子结合糖蛋白,参与铁的转运,并具有抗菌、抗病毒、抗癌、调节免疫系统、抗氧化和促进骨骼生长等功能[1,2]。牛乳铁蛋白虽然具有一定的抗菌活性,但酶解后可获得活性更高的抗菌肽段。已有若干种抗菌肽段从牛乳铁蛋白的酶解液中获得,其中牛乳铁蛋白素(bovine lactoferricin,LfcinB)因抗菌活性最强而成为研究热点[3,4]。LfcinB来源于牛乳铁蛋白的第17～41位氨基酸,由25个氨基酸残基组成,氨基酸顺序为Phe(F)-Lys(K)-Cys(C)-A rg(R)-A rg(R)-Trp(W)-G ln(Q)-Trp(W)-A rg(R)-M et(M)-Lys(K)-Lys(K)-Leu(L)-G ly(G)-A la(A)-Pro(P)-Ser(S)-Ile(I)-Thr(T)-Cys(C)-Val(V)-A rg(R)-A rg(R)-A la(A)-Phe(F),包括5个A rg、2个Trp和多个芳香族氨基酸残基,具有强碱性,其p I>8.5,相对分子质量(Mr)为3 124,其中的2个Cys通过形成分子内二硫键使LfcinB分子呈环状结构[5,6]。LfcinB还具有普通抗生素所不具有的一系列优点,特别是广谱的抗菌能力和不易产生耐药性等特点。此外,它在抑制病毒、真菌和肿瘤细胞的同时,对真核细胞几乎没有毒性[7-9]。

近年来,研究人员一直寻求建立一种快速分离、鉴定LfcinB的方法。1991年,Tom ita等[10]酶解乳铁蛋白得到LfcinB粗组分,然后利用液相色谱和电泳方法分离鉴定LfcinB。1998年,Sh im azaki等[11]通过色谱方法分离得到LfcinB,并结合液相色谱-质谱和N端氨基酸分析鉴定了LfcinB。2007年,庞广昌等[12]利用超滤的方法得到纯度分别为40%和80%的LfcinB。本文建立的方法通过色谱技术分离得到LfcinB,并利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALD I-TO F/TO F MS)快速鉴定LfcinB的氨基酸序列。与其他传统的分析鉴定LfcinB的方法相比,本方法具有精度高、分析速度快和分辨能力强等优点,为进一步研究LfcinB奠定了基础。

1 实验部分

1.1 原料、试剂和仪器

1.1.1 原料和主要试剂

乳铁蛋白购自Sigm a公司,大肠杆菌(E.coli)ATCC25922购自黑龙江省微生物研究所,金黄色葡萄球菌(S.au reus)ATCC25923购自中国药品生物制品检定所,磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸二氢钠(分析纯)、乙腈(色谱纯)、三氟乙酸(TFA,色谱纯)、胃蛋白酶和BCA蛋白浓度(增强型)测定试剂盒(碧云天生物技术研究所),α-氰基-4-羟基肉桂酸和营养肉汤培养基(北京奥博星生物技术责任有限公司)。

1.1.2 仪器设备

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

称取5g牛乳铁蛋白溶于100mL水中,用1 mol/L的HCl调节溶液pH至2.5,然后加入胃蛋白酶在37℃下酶解4h,酶解液在80℃下加热15 m in,使酶完全失活。将酶解液冷却到20℃,滴加1 mol/L的N aOH调节溶液pH至7.0,于4℃下离心(17 000g)15m in,收集上清液,置于4℃下保存待用。

1.2.2 离子交换色谱法分离LfcinB

阳离子交换色谱柱:H iTrap SP XL(1mL,美国Am ersham公司)。进样量:500μL。检测波长:215 nm。流动相:A溶液,50mmol/L N a3PO4水溶液(含10%乙腈);B溶液,50mmol/L N a3PO4水溶液(含1mol/L N aC l和10%乙腈)。于25℃下进行分离。用A溶液平衡15m in后进样。先用A溶液淋洗11m in,除去杂蛋白。再进行梯度洗脱:第一步用50%的B溶液洗脱15m in,第二步用100%的B溶液洗脱10m in,流速为1mL/m in。收集第二步梯度洗脱峰,得到LfcinB的粗分离组分。将粗分离组分放置于截流Mr为1 000的半透膜中,在pH 8.0的超纯水中透析24h,脱盐后冻干保存。

1.2.3 反相液相色谱法分离LfcinB

反相液相色谱柱:SOURCETM5RPC ST(150 mm×4.6mm,美国Am ersham公司)。进样量:500μL。检测波长:215nm。流动相:A溶液,0.1%(体积分数)的三氟乙酸水溶液;B溶液,乙腈-0.09%三氟乙酸水溶液(9∶1,v/v)。25℃下进一步分离。先用20%的B溶液平衡5m in再进样,然后进行线性洗脱:在30m in内从20%B溶液升到50%B溶液,流速为1mL/m in。收集相应的洗脱峰并冻干。

1.2.4 抗菌活性分析

抗菌活性测定采用琼脂扩散法,选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌做指示菌。1.2%(质量分数)的素琼脂,按每个培养皿10mL倾倒在无菌培养皿中晾干;制备含0.7%(质量分数)琼脂的软琼脂培养基,冷却至50℃左右,每100mL接入0.6mL过夜培养的指示菌菌液,在底层有琼脂的培养皿上倾倒8mL含有指示菌的软琼脂培养基晾干;用打孔器在涂有指示菌的培养基上打孔,孔直径8mm;分别在孔中加入200μL质量浓度为1m g/mL反相液相色谱分离得到的洗脱峰溶液,超净工作台上放置3h;置于37℃下培养16h。用游标卡尺测量抗菌圈直径。

第一，这是稻谷生产合作社办的。“粮食银行”的运行，与合作社提供的其他各项生产服务密切联系在一起，能够让农民有获得感，同时合作社也能较好地减轻收购资金的压力，获得优质稻谷原料，“粮食银行”的各种运行成本也能够降到最低。

1.2.5 LfcinB的蛋白质浓度的测定

以牛血清白蛋白(BSA)为标准样品,按碧云天生物技术研究所BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)说明书指导,将标准品加入96孔板,用酶标仪在570nm波长下测定光吸收值;根据已知的标准品BSA浓度,用直线回归法拟合标准曲线,再根据待测样品的光吸收值算出蛋白的质量浓度(μg/mL)。

1.2.6 MALD I-TO F/TO F MS分析

肽段的Mr分析:称取具有抗菌活性的冻干样品1μg,溶解于100μL乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(1∶1,v/v),取0.8μL点靶,等样品自然干燥后再点0.5μL基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸),自然干燥后,将靶装入质谱仪中进行分析。仪器参数:反射模式,扫描范围m/z1 000～3 500,激光能量MS 4 500,质谱信号的单次扫描累加200次,正离子谱测定。

肽段质量指纹谱分析及肽段二级质谱鉴定:称取具有抗菌活性的冻干样品1μg,溶解于100μL乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液(1∶1,v/v)中,取0.8 μL点靶,等样品自然干燥后再点0.5μL基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸),自然干燥后,将靶装入质谱仪进行分析。仪器参数:反射模式,扫描范围m/z800～1 500,激光能量MS4 500,MS/MS5 500,质谱信号的单次扫描累加150次,正离子谱测定。

2 结果与讨论

2.1 离子交换色谱法分离LfcinB

采用H iTrap SP XL柱分离LfcinB,因LfcinB自身带正电荷,故采用阳离子交换法进行分离。按1.2.2节的条件进行洗脱,得到的色谱图见图1。收集梯度洗脱峰A2组分(27～32m in),充分透析后真空冷冻干燥。

2.2 反相液相色谱法分离LfcinB

采用SOURCETM5RPC ST反相色谱柱进一步分离图1中的A2组分,按1.2.3节方法进行分离,主要得到5个组分(见图2)。分别收集各个组分并冷冻干燥,测定各组分的抗菌活性。

图1 离子交换色谱分离LfcinB的色谱图Fig.1 Chromatogram of the LfcinB separated by ion exchange chromatography

图2 反相液相色谱分离图1中的A2组分的色谱图Fig.2 Chromatogram of the A2in Fig.1 separated by RP-LC

2.3 抗菌活性分析

由图3和图4可见,反相液相色谱分离得到的5个组分中,只有F2组分对指示菌金黄色葡萄球菌ATCC25923和指示菌大肠杆菌ATCC25922都产生明显的抗菌圈,其余4个组分均未产生明显的抗菌圈。初步判定F2组分为LfcinB。

2.4 LfcinB的蛋白质浓度的测定

按碧云天生物技术研究所BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)说明书要求,用牛血清白蛋白做标准曲线,测定F2组分的蛋白质浓度,标准曲线线性范围是10～2 000μg/mL,线性方程为y=0.029x+0.092 1(y为吸光值;x为蛋白质的质量浓度,μg/mL)。在570nm波长下检测光吸收值,在96微孔板中按一定浓度分别加入20μL标准蛋白(BSA)稀释液和F2组分后,再加入200μL BCA工作液,于37℃下放置20～30m in,然后用酶标仪测得F2组分的吸光值为0.62。根据线性方程计算F2组分的蛋白质的质量浓度为18.20μg/mL。

图3 图2中5个组分对金黄色葡萄球菌的抗菌活性Fig.3 Antibacterial activities of5components in Fig.2to S.aureus

图4 图2中5个组分对大肠杆菌的抗菌活性Fig.4 A n tibacte ria l activities of5components in Fig.2to E.coli

2.5 MALD I-TO F/TO F M S分析

采用MALD I-TO F/TO F MS对分离纯化得到的有抗菌活性的F2组分进行更准确的鉴定分析。LfcinB的理论序列为FKCRR WQWRM KKLGA PSITCVRRAF。由于胰酶酶解位点是R和K,用胰酶酶解LfcinB会导致肽段被分解得太小,无法得到理想的图谱,所以F2组分不经酶解而直接点靶。LfcinB肽段的Mr计算值为3 124.68,实际测定F2组分的Mr为3 124.89(见图5),图5中m/z 1 562.93为F2组分的双电荷离子峰。实际测得的F2组分的Mr与LfcinB计算值接近,故初步判定F2组分为LfcinB。

对F2组分进行肽指纹图谱鉴定,扫描范围为m/z800～1 500,F2组分指纹图谱中共有4段肽段与LfcinB的理论肽段匹配(见图6),分别是m/z 831.46,m/z1 073.60,m/z1 201.70和m/z 1 229.68,其质谱峰归属见表1。

图5 图2中F2组分的MALD I-TO F M S一级质谱图Fig.5 MALD I-TO F M S spectrum of F2 component in Fig.2

图6 图2中F2组分的质量指纹质谱图Fig.6 mass fingerprint spectrum of F2 component in Fig.2

选择F2组分质量指纹图谱中信号强度高的m/z831.46和m/z1 073.60肽段进行MS/MS序列分析。在m/z831.46和m/z1 073.60的二级质谱图中都可以看到连续的b和y离子峰(见图7和图8),表明2个丰度很高的m/z831.46和m/z 1 073.60肽段与LfcinB的氨基酸序列RWQWR和LGAPSITCVR匹配。因此,根据一级质谱和二级质谱的鉴定结果,可以确认F2组分为LfcinB。

表1 F2组分与LfcinB的理论肽段匹配的质谱峰归属Table1 M Speak attributions of F2component

图7 图6中m/z831.46(肽段RWQWR)的MALD I-TO F/TO F M S二级质谱图Fig.7 MALD I-TO F/TO F M S spectrum of m/z831.46(p ep tide RWQWR)in Fig.6

图8 图6中m/z1073.60(肽段LGA PS ITCVR)的MALD I-TO F-TO F-M S二级质谱图Fig.8 MALD I-TO F/TO F M S spectrum of m/z1073.60(p ep tide LGAPS ITCVR)in Fig.6

3 结论

本方法选用牛乳铁蛋白为原料,采用离子色谱、反相液相色谱方法分离LfcinB,经抗菌活性分析和MALD I-TO F-TO F-MS鉴定,得到具有抗菌活性的组分LfcinB,其Mr为3 124.89,蛋白质的质量浓度为18.20μg/mL。同时,采用MALD I-TO F-TO F-MS对分离得到的目标产物进行鉴定,具有精度高、分析速度快和分辨能力强等优点,是其他传统的分析鉴定LfcinB方法所无法比拟的。致谢 衷心感谢北京蛋白质组研究中心的贺福初院士、钱小红老师、蔡耘老师、田芳老师和宋丽娜老师在实验过程中给予的指导与帮助。

[1] Cornish J,Palmano K,Callon K E,et al.Biochem Cell Biol,2006,84:297

[2] Lorget F,Clough J,Oliveira M,et al.Biochem Biophys Res Commun,2002,296:261

[3] Gifford J L,Hunter H N,Voge H J.Cellmol Life Sci,2005,62:2588

[4] Jenssen H.CellMol Life Sci,2005,62:3002

[5] Dionysius D A,Milne J M.J Dairy Sci,1997,80:667

[6] Hoek K S,Milne J M,Grieve P A,et al.Antimicrob Agents Chem other,1997,41(1):54

[7] M ader J S,Salsm an J,Conrad D M,et al.mol Cancer Ther,2005,4(4):612

[8] M ader J S,Richardson A,Salsman J,et al.Exp Cell Res,2007,313:2634

[9] Furlong S J,Ridgway N,Hoskin D W.Int J Oncol.2008,32:537

[10] Tomita M,BellamyW,Takase M,et al.J Dairy Sci,1991,74:4137

[11] Shimazaki K,Tazume T,U ji K,et al.J Dairy Sci,1998,81:2841

[12] Hu Z H,Feng F,Pang G C.Food Science(胡志和,冯飞,庞广昌.食品科学),2008,29(7):166

Separation and identification of bovine lactoferricin by high performance liquid chroma to graphy-matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight/time of flight mass spectrometry

AN Meichen,LIU Ning＊
(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0180-05

＊通讯联系人:刘 宁,博士,教授,研究方向为营养与乳制品加工.Tel:(0451)55191827,E-m ail:ningliu6666@yahoo.com.cn.

东北农业大学创新团队基金项目(No.CXT007-3-1).

2009-06-30

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00180