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天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂在二氧化钛选择性富集磷酸肽中的应用

2010-10-21宋丽娜张养军钱小红

色谱 2010年2期
关键词:天冬氨酸二氧化钛谷氨酸

迟 明, 毕 炜, 卢 庄, 宋丽娜, 贾 伟, 张养军, 钱小红, 蔡 耘

(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京102206)

天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂在二氧化钛选择性富集磷酸肽中的应用

迟 明, 毕 炜, 卢 庄, 宋丽娜, 贾 伟, 张养军, 钱小红, 蔡 耘*

(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,北京蛋白质组研究中心,北京102206)

二氧化钛富集法作为目前使用最为广泛的金属氧化物富集磷酸肽的方法,在富集过程中常常对富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性非磷酸化肽段存在一定的非特异性吸附作用。这些肽段与磷酸化肽段一同被富集,降低了磷酸肽富集的选择性。传统方法中使用的非特异性吸附抑制剂常会对质谱的电喷雾离子源造成污染,因而限制了其在液相色谱-质谱联用(LC-MS)系统中的应用。本研究将天冬氨酸作为一种新型的非特异性吸附抑制剂加入到二氧化钛富集体系中,并分别对3种和9种标准蛋白质酶切肽段混合物进行富集实验,同时与添加另一种非特异性吸附抑制剂——谷氨酸以及不添加任何非特异性吸附抑制剂的富集体系进行了富集效果的比较。结果表明,天冬氨酸可以有效地提高二氧化钛对磷酸肽富集的选择性。将添加天冬氨酸的二氧化钛富集体系应用于鼠肝全蛋白质磷酸肽的富集中,同样取得了很好的效果,表明天冬氨酸在复杂的生物样本的磷酸肽富集中也同样具有良好的应用前景。此外,由于天冬氨酸在反相色谱中极易被洗脱去除,从而避免了传统抑制剂对LC-MS系统离子源的污染问题。

二氧化钛;富集;非特异性吸附抑制剂;天冬氨酸;磷酸肽;鼠肝

Abstract:Titanium dioxide(TiO2)is one of metal oxides widely used for phosphopep tide enrichment in phosphop roteomic research now a days.How ever it can bind to some non-phosphorylated peptides containing one or more aspartic acid residues and/or glutamic acid residues.These non-phosphorylated pep tides can be eluted along with phosphorylated pep tides and cause the reduction of the selectivity.Conventional inhibitors for the non-specific binding of nonphosphorylated pep tides can often contaminate the ion source of mass spectrometry and therefore their applications are limited in liquid Chromatography-mass spectrometry(LC-MS).In this study,aspartic acid was reported as a novel non-specific binding inhibitor for phosphopeptide enrichment by titanium dioxide.Firstly,the tryptic peptide mixtures of3and9standard proteins were used for the comparison of the enrichment efficiency of titanium dioxide.The effects with the presence of aspartic acid,glutamic acid and no-inhibitor in the enrichment system s were com pared separately.The results show ed that as partic acid can greatly improve the selectivity of titanium dioxide for phosphopep tide enrichment.Then,aspartic acid was used for the enrichment of tryptic pep tide mixture of C57BL/6J mouse liverlysate and good results were also obtained which demonstrated that aspartic acid was a promising non-specific binding inhib-it or for complex biological samples.Besides,no contamination in the ion source occurred during the mass spectrometric analysis.

Key words:titanium dioxide;enrichment;non-specific binding inhibitor;asparticacid;phosphopeptides;mouse liver

蛋白质的磷酸化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程是细胞内信号转导、基因表达等诸多生命过程中最普遍也是最重要的调控手段之一[1],在生物学功能研究领域受到广泛的关注。以质谱技术为核心的磷酸化蛋白质组学研究的方法可以系统、规模化地对复杂体系中的磷酸化蛋白质进行定性及定量分析,从而为与蛋白质磷酸化相关的各种生物学功能研究提供通量化的技术平台和极有价值的数据集。但由于磷酸化修饰的蛋白质含量少、化学计量值低、质谱检测离子化效率低,使得磷酸肽的质谱检测较为困难。而在复杂的生物样本中,大量高丰度、非磷酸化肽段的存在进一步抑制了磷酸肽的质谱信号,若对生物样品直接进行质谱分析,磷酸肽的检出率会更低,因此在质谱检测前对磷酸化肽段进行相应的分离富集是必不可少的步骤之一。目前比较常用的磷酸肽富集方法包括固定化金属离子亲和色谱法( IMAC),如Fe3+- IMAC[2]、Ga3+- IMAC[3]、Zr4+- IMAC[4]等;金属氧化物富集法,如二氧化钛[5]、二氧化锆[6]等;离子交换色谱法,如强阳离子交换色谱(SCX)[7]、强阴离子交换色谱(SAX)[8]等。其中金属氧化物富集法特别是二氧化钛富集法,由于对磷酸肽的富集效果好,且价格低廉、操作简便,从而成为最为广泛的磷酸肽富集方法之一。但由于二氧化钛除了可以吸附磷酸基团外,对天冬氨酸及谷氨酸这样的酸性氨基酸也有一定的吸附作用,因而在富集磷酸肽的同时也富集了富含天冬氨酸及谷氨酸残基的非磷酸肽,从而对磷酸肽的质谱检测造成一定的干扰。为了减少这些非磷酸肽与二氧化钛的结合,常常在上样缓冲液中加入一些含苯环的小分子有机酸作为抑制剂来减少这种非特异性吸附,常用的有机酸有2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)和邻苯二甲酸(PA)[9]。但由于这两种有机酸会造成电喷雾离子源的污染,因此此类抑制剂在液相色谱-质谱联用(LC-MS)系统中的应用受到一定的限制。W u等[10]采用谷氨酸这种酸性氨基酸作为非特异性吸附抑制剂,避免了对LC-MS系统中电喷雾离子源的污染,同时取得了很好的磷酸肽富集效果。本文选择另一种侧链含有羧基的酸性氨基酸——天冬氨酸作为二氧化钛富集方法中的非特异性吸附抑制剂,并通过对标准蛋白质酶切肽段混合物及复杂样品中磷酸肽的富集效果的考察和比较,发现天冬氨酸可以作为一种新型、有效的非特异性吸附抑制剂,它可以显著提高二氧化钛富集磷酸肽的效率。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LCQ-Deca质谱仪(Therm o Fisher公司);LTQ-FTICR质谱仪(Thermo Fisher公司);高效液相色谱仪(Agilent1100型,Agilent Technologies公司);蛋白测定仪(SmartSpec Plus,Bio-Rad公司);组织匀浆器(15mL,D ounce,美国安普科技中心);恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);真空冰冻干燥机(SC100A Speedvac Plus,Thermo Savant公司);冷冻高速离心机(3K30,Sigma公司);体外超声仪(Vibra Cell,Sonics公司);旋转混合器(DH-II,宁波新芝生物科技股份有限公司)。α-酪蛋白(α-casein)、β-酪蛋白(β-casein)、卵清蛋白(ovalbum in)、心肌红蛋白(myoglobin)、溶菌酶(lysozyme)、细胞色素C(cytochrome C)、α-淀粉酶(α-amylase)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)、磷酸酶抑制剂(美国Sigm a公司);牛血清白蛋白(bovine serum album in,BSA,北京方润生物科技有限公司)。蛋白酶抑制剂(complete protease inhibitor cocktail tablets)(瑞士Roche公司);测序级胰蛋白酶(trypsin)、1,4-二硫苏糖醇(D TT)(美国Prom ega公司);碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)、Bradford定量试剂盒(美国Bio-Rad公司);分析纯乙醇、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠、尿素、碳酸氢铵、氟化钠、焦磷酸钠、矾酸钠(北京化学试剂公司)。三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)(德国Aldrich公司);色谱纯乙腈(acetonitrile,ACN)(美国J.T.B aker公司);25%氨水(NH3·H2O)、甲酸(formic acid,FA)(美国Fluka公司);去离子水(由美国M illipore公司M illi-Q纯水系统制备)。二氧化钛颗粒(粒径40μm,孔径30nm)(Sachtleben Chemie GmbH)。C18填料(北京金欧亚公司)。Sp in柱管(美国Pierce公司)。

实验动物为C57BL/6J(8~9周龄)小鼠(军事医学科学院实验动物中心)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准蛋白质混合物的制备

3种标准蛋白质混合物由α-酪蛋白、β-酪蛋白和卵清蛋白组成;9种标准蛋白质混合物由α-酪蛋白、β-酪蛋白、卵清蛋白、心肌红蛋白、细胞色素C、α-淀粉酶、β-乳球蛋白、溶菌酶和BSA组成。每种蛋白质的质量浓度均为1μg/μL。

1.2.2 C57BL/6J小鼠肝脏蛋白质的制备

实验前小鼠禁食16h,自由饮水。采用颈部脱臼法处死小鼠后立即取肝脏,称重后加入裂解液(9.5mol/L尿素/1%D TT/磷酸酶抑制剂(与裂解液体积比为1∶100)/蛋白酶抑制剂(1片/50mL裂解液))(按照5mL/g的比例)。冰上匀浆后超声破碎细胞(每次超声1s,暂停1s;共计60次),于40 000g下冷冻离心1h,取蛋白质层样本用B radford法进行蛋白质定量。样本分装后于-80℃下保存。

1.2.3 蛋白质酶切产物的制备

将蛋白质以1m g/mL的质量浓度溶于50 mmol/L碳酸氢铵溶液中,加入适量D TT至其最终浓度为10mmol/L,在56℃下变性1h后加入适量IAA至其最终浓度为55mmol/L,室温下暗处放置1h,按m(蛋白质)/m(酶)=50∶1的比例加入胰蛋白酶,于37℃水浴中酶解12h。

1.2.4 酶切产物的脱盐

将标准蛋白质的酶切产物按每种蛋白质肽段20pmol/μL的比例混合,每次实验取1μL。鼠肝全蛋白质样本取150μg,用0.1%TFA将样本稀释至400μL,并确认pH<3。将适量的C18填料装填入Sp in柱管中,将其作为脱盐柱,预先用ACN活化后,用0.1%TFA平衡。将前述样品溶液上样至脱盐柱,然后用0.1%TFA溶液去除盐组分,最后用80%的ACN溶液洗脱肽段。

1.2.5 酶切产物磷酸肽的富集

所采用的富集方法为略有改进的B ahl等[11]和Thingho lm等[12]方法。将脱盐后的酶切产物溶液的组成调整为60%ACN/5%TFA,然后分别加入天冬氨酸或谷氨酸至饱和;每管中加入10m g二氧化钛颗粒,在室温下富集1h,随后用200μL50%ACN/0.1%TFA溶液洗去非特异性结合的肽段,再用200μL50%ACN溶液洗涤一次。最后用100μL 0.3mol/L氨水(pH10.5)将结合在T iO2上的磷酸肽洗脱下来。真空冻干,于-20℃下保存待用。

1.2.6 分析条件

(1)标准蛋白质酶切产物的分析条件

色谱条件:预柱为C18柱(5mm×100μm,5 μm),分析柱为PicoFritTM反相柱(BioBasic C18,10cm×75μm,5μm,美国New O bjective公司),喷头直径为15μm。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液;流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液。流速:300nL/m in。梯度设置:0-4.5m in,0.1%B-4%B;4.5-65m in,4%B-40%B;65-67m in,40%B-100%B;67-80m in,100%B;80-82 min,100%B-4%B。

质谱条件:使用Finnigan Proteome X系统连接LCQ-Deca质谱检测系统。采用全扫描(m/z 350~1 800)的一级质谱和数据依赖的二级质谱扫描模式(data dependent MS/MS scan),依次选取一级质谱中离子强度最强的3个离子进行二级质谱检测,动态排除时间为30s。实验在质谱水平上重复进行3次。

(2)C57BL/6J小鼠肝脏蛋白质酶切产物的分析条件

色谱条件:流动相A为含0.1%甲酸的水溶液-乙腈(98∶2,v/v);流动相B为含0.1%甲酸的水溶液-乙腈(20∶80,v/v)。流速:300nL/m in。梯度设置:0-14m in,100%A;14-15m in,100%A-5%B;15-105m in,5%B-50%B;105-115 m in,50%B-100%B;115-125m in,100%B;125-126m in,100%B-100%A。

质谱条件:采用配备纳升级电喷雾源的LTQFTICR质谱仪,与Agilent1100高效液相色谱仪串联使用。采用全扫描(m/z400~1 600)的一级质谱和数据依赖的二级质谱扫描模式,依次选取一级质谱中离子强度最强的10个离子进行二级质谱检测,动态排除时间为30s。实验在质谱水平上重复进行3次。

1.2.7 数据检索

(1)标准蛋白质的数据检索

串联质谱数据使用Thermo Finnigan Bioworks3.2整合的Sequest软件对UniProt数据库进行检索。参数设置:固定修饰选择Carbam idomethyl(C),可变修饰选择O xidation(M)、Phosphorylation(ST)和Phosphorylation(Y),允许酶切的肽段有2个漏切位点,肽质量误差1.4。数据过滤参数设置:单电荷肽段Xcorr≥1.5,二电荷肽段Xcorr≥2.0,三电荷肽段Xcorr≥2.5;ΔCn≥0.08(ΔCn:排名前两位的两条肽段得分的差值)。

(2)鼠肝全蛋白质的数据检索

数据检索使用M ascot搜索引擎进行。数据库为IPI mouse正反库(Version3.53),参数设置:母离子质量误差0.001%,MS/MS碎片离子质量误差为0.8,允许存在2个漏切位点,固定修饰选择Carbamidomethyl(C),可变修饰选择O xidation(M)、Phosphorylation(ST)和Phosphorylation(Y)。根据M ascot搜索结果卡分设置为31分(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂的原理

磷酸肽和非磷酸肽与二氧化钛结合的化学原理不同,因此文献中常有使用2,5-DHB和PA作为非特异性吸附抑制剂抑制非磷酸肽与二氧化钛的结合。但这两种有机酸都会造成电喷雾离子源的污染。而电喷雾离子源是LC-MS系统中最常使用的离子源,在蛋白质组学研究中,特别是针对极其微量的蛋白质的磷酸化修饰研究中,LC-MS系统是必不可少的技术平台,因此采用高浓度的2,5-DHB或PA作为非特异性吸附抑制剂的溶液体系在复杂样品的磷酸化蛋白质分析中受到了一定的限制。为了避免2,5-DHB或PA对电喷雾离子源的污染,有人[10]采用谷氨酸作为二氧化钛的非特异性吸附抑制剂,取得了很好的磷酸肽富集效果。天冬氨酸和谷氨酸均为含有两个羧酸基团的直链化合物(结构式见图1),在溶液中,两个羧酸基可能通过配位作用与二氧化钛结合。在LC-MS系统中,天冬氨酸和谷氨酸不会在反相色谱柱上保留,可以很容易地通过在线脱盐步骤被清除,因此不会对LC及电喷雾电离源造成污染。此外,与谷氨酸相比,天冬氨酸具有较短的碳链,空间位阻较小,酸性较强,因此以天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂时会更有效地去除非磷酸化肽段。

图1 天冬氨酸和谷氨酸的结构式Fig.1 Sructures of aspartic acid and glutamic acid

2.2 天冬氨酸对标准蛋白质磷酸肽富集效果的影响

以天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂,对3种标准蛋白质的酶切肽段混合物中的磷酸肽进行富集,考察天冬氨酸对富集效果的影响。在二氧化钛反应溶液中分别添加天冬氨酸、谷氨酸作为非特异性吸附抑制剂及不添加任何非特异性吸附抑制剂作为对照实验,结果见表1。表1中“Redundant peptide”代表鉴定到的冗余肽段,“Unique peptide”代表鉴定到的非冗余肽段。从该结果可以看出,在溶液体系中加入非特异性吸附抑制剂能降低非磷酸肽在二氧化钛材料上的吸附,提高二氧化钛富集磷酸肽的选择性。其中,采用天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂富集的组分,经质谱鉴定到的所有肽段均为磷酸肽,即二氧化钛对磷酸肽的选择性为100%,其富集磷酸肽的效果明显优于使用谷氨酸及不添加任何非特异性吸附抑制剂的富集体系。

表1 3种标准磷酸化蛋白质酶切肽段混合物富集鉴定结果Table1 Enrichment results for tryptic peptides from 3 standard prote in mixture

实际的生物样本的组成更复杂,且非磷酸化蛋白质的含量远远高于磷酸化蛋白质的含量。为了模拟真实样本,我们采用了更为复杂的9种标准蛋白质(3种磷酸化蛋白质,6种非磷酸化蛋白质)的酶切肽段混合物对天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂时磷酸肽的富集效果作了进一步的考察,结果见表2。从表2中可以看出,对于更复杂的样品体系,二氧化钛对磷酸肽的富集选择性大小顺序依次为:添加天冬氨酸的富集体系(93.26%)>添加谷氨酸的富集体系(92.89%)>不添加抑制剂的富集体系(72.24%)。

表2 9种标准蛋白质酶切肽段混合物的富集鉴定结果Table2 Enrichment results for tryptic peptides from 9 standard prote in mixture

将两种标准蛋白质体系的考察结果进行比较后不难看出,在相对复杂的体系中,添加天冬氨酸可以将二氧化钛的富集选择性提高20%以上;而在相对简单的体系中,添加天冬氨酸只将二氧化钛的富集选择性提高了7%。因此,我们推测样品体系越复杂,天冬氨酸对二氧化钛富集磷酸肽的选择性的提高效果越显著。

2.3 天冬氨酸对复杂生物样本中磷酸肽富集效果的影响

在磷酸化蛋白质组学研究中,样品的复杂程度远远大于上述标准蛋白质的酶切肽段混合物。为了考察天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂在实际复杂样本中的使用效果,我们使用C57BL/6J小鼠肝脏全蛋白质作为样本,分别对添加天冬氨酸、谷氨酸作为抑制剂及不添加抑制剂的二氧化钛富集体系对磷酸肽的富集效果进行了比较,结果见表3。从结果可以看出,添加天冬氨酸可以非常有效地增加复杂样本中二氧化钛对磷酸肽的选择性,且效果略优于谷氨酸。每个组别的实验重复3次,没有观察到明显的离子源污染现象。实验结果充分说明了天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂在磷酸化蛋白质组学研究中的有效性和实用性,也证实了我们前面在标准蛋白质实验中所作出的推测,即在越复杂的体系(如实际生物样本)中,天冬氨酸对提高二氧化钛材料的富集选择性的效果越显著。

此外,从表3的结果还可以看出,虽然加入天冬氨酸或谷氨酸能非常有效地提高二氧化钛富集磷酸肽的选择性,但该体系用于复杂样本的选择性仍然只有大约50%,远远低于在标准蛋白质混合物中的选择性,说明实际样品组成的高度复杂性给磷酸肽富集带来了更多的困难。这个问题可以通过降低样本的复杂程度来解决,即在富集之前对样本进行预分离或用其他的策略对磷酸肽进行预富集。

表3 鼠肝全蛋白质酶切肽段混合物的富集鉴定结果Table3 Enrichment results for tryptic peptides from C57BL/6J mouse live rlysate

2.4 样本的复杂程度对天冬氨酸作为非特异性吸附抑制剂效果的影响

通过上面的研究可以看出,在不同复杂程度的样本中,是否使用非特异性吸附抑制剂及所用抑制剂的种类对二氧化钛富集的选择性具有不同的作用。图2展示了不同的样本复杂程度下非特异性吸附抑制剂对二氧化钛富集选择性的影响。在样本相对简单的情况(3种标准蛋白质混合物)下,是否添加抑制剂对选择性的影响并不是很明显;而在相对复杂的情况(9种标准蛋白混合物)下,非特异性吸附抑制剂对磷酸肽的二氧化钛富集展现出其作用的有效性;当使用实际的复杂样本(鼠肝全蛋白)时,富集的结果充分证实了添加非特异性吸附抑制剂的必要性。在不同样本复杂程度下,天冬氨酸作为抑制剂的效果均略优于谷氨酸,显示了其作为非特异性吸附抑制剂在二氧化钛富集磷酸肽过程中的有效性。隋少卉等[13]证明经由SCX分离降低系统复杂度有助于磷酸化肽段的鉴定。因此我们推测,在添加非特异性吸附抑制剂的二氧化钛富集方法前对样本进行初分离可进一步提高材料的选择性。这种推测需要后续实验进一步证明。

图2 样本复杂程度及抑制剂对二氧化钛富集选择性的影响Fig.2 Effects of sample complexities and inhibitors on the selectivity of titanium dioxide enrichment

3 结论

在二氧化钛富集体系中,天冬氨酸作为新型的非特异性吸附抑制剂能有效地提高二氧化钛富集磷酸肽的选择性。天冬氨酸在反相色谱柱上的保留很弱,很容易通过在线脱盐步骤被清除,避免了对电喷雾离子源的污染,从而实现了二氧化钛高效富集磷酸肽的方法与LC-MS系统的有效联接。这一富集方法的改进在磷酸化蛋白质组学相关领域研究中具有重要的实用价值。

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Application of asp artic acid as a non-specific binding inhibitor in the enrichment of phosphopep tides with titanium dioxide

CHIMing,BIWei,LU Zhuang,SONG Lina,JIA Wei,ZHANG Yangjun,QIAN Xiaohong,CAI Yun*
(Sta te Key Laboratory of Proteomics,Beijing Proteome Research Center,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 102206,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0152-06

*通讯联系人:蔡 耘,研究员,硕士生导师.Tel:(010)80705188,E-m ail:caiy_2007@yahoo.com.cn.

国家重点基础研究发展(“973”)计划项目(No.2006CB910801)、国家高技术研究发展(“863”)计划项目(No.2008AA02Z309)、国家自然科学基金项目(Nos.20735005,20875101,20905077)和蛋白质组学国家重点实验室项目(Nos.SKLP-K200807,SKLP-O200808).

2009-12-28

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00152

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